Células madre obtenidas a partir de médula ósea para la regeneración de tejidos.

Un procedimiento para la separación de células de la médula ósea que comprende las etapas de:

a) centrifugar la médula ósea;

b) recoger la capa leucocitaria formada después de la etapa a) con un volumen de glóbulos rojos por debajo de la capa leucocitaria, el volumen de glóbulos rojos recogido es 1 a 20 veces, preferentemente 1 a 10 veces, más preferentemente 2 a 5 veces e incluso más preferentemente 5 veces el de la capa leucocitaria;

c) centrifugar la capa leucocitaria con el volumen de glóbulos rojos por debajo de la capa leucocitaria, obtenida en la etapa b); y

d) recoger la capa leucocitaria formada después de la etapa c).

Células madre obtenidas a partir de médula ósea para la regeneración de tejidos Campo de la invención

La invención se refiere a células y en particular a células madre obtenidas a partir de la médula ósea que se pueden utilizar como una preparación terapéutica para la reparación celular y mejorar la regeneración de tejidos.

Antecedentes de la invención

La cicatrización normal de la piel después de una herida o lesión es un proceso complejo y dinámico que implica la reparación de estructuras celulares y de capas tisulares después de una lesión en la piel y en otros tejidos blandos. El proceso de curación se considera generalmente que tiene lugar en tres fases.

En primer lugar hay una fase de coagulación en la que las proteínas que espesan la sangre y las plaquetas de la sangre taponan una herida para evitar la pérdida de sangre. Después hay una fase inflamatoria en la que los leucocitos son enviados a combatir la infección. Finalmente hay una fase de reparación en la que las células del tejido restauran la integridad de las áreas dañadas.

Todas las cicatrizaciones producen por lo general una cicatriz que está causada hasta cierto punto por la reparación incompleta de la estructura inicial de la piel y la alteración de la alineación normal de las fibras de colágeno.

Además, hay dolencias y enfermedades específicas que pueden dar como resultado heridas y lesiones crónicas de la piel, tales como las úlceras y las heridas ulcerosas de la diabetes. También otros trastornos, tales como la parálisis y la vejez, pueden dar lugar a lesiones graves de la piel como resultado de una presión infligida sobre heridas, como las escaras.

El tejido cardiaco muscular está formado por cardiomiocitos. Estas formas especializadas de células musculares no son capaces de regenerarse después de una lesión en una persona adulta. Las lesiones más comunes en el músculo cardiaco se producen en ataques cardiacos isquémicos durante los cuales está restringido el flujo sanguíneo hasta el corazón y el músculo cardiaco se daña por hipoxia. Los pacientes que padecen un infarto cardiaco requieren tanto la restauración del suministro sanguíneo al corazón como la regeneración del músculo cardíaco dañado.

El sistema nervioso central compuesto de neuronas y otras células nerviosas es incapaz generalmente de regenerarse en una persona adulta y el sistema nervioso periférico solo es capaz de una regeneración limitada. Las dolencias que generalmente dan lugar a lesiones en el sistema nervioso central son la esclerosis múltiple y la esclerosis lateral amiotrófica.

Los incidentes que comúnmente dan como resultado lesiones en el sistema nervioso central son lesiones de la médula espinal y los accidentes vasculares cerebrales.

La incontinencia urinaria puede ser el resultado de una lesión de los esfínteres de la uretra.

Diversos trastornos pueden dar lugar a una lesión hepática, incluyendo la hepatitis vírica, la cirrosis, la esteatohepatitis y el cáncer de hígado.

La diabetes puede dar como resultado una lesión similar y degeneración del páncreas.

La artritis es una forma de degradación y lesión en las articulaciones entre los huesos.

Por lo tanto, existe una necesidad de producir estrategias terapéuticas para mejorar estos trastornos, ya sean el resultado de una patología o la imperfección natural de la curación de la piel, o una incapacidad del tejido cardiaco o del tejido nervioso o del cartílago o de las articulaciones o del tejido hepático o de los esfínteres uretrales para regenerarse, o una diabetes causada por la degeneración del páncreas. Además, hay una necesidad de estrategias terapéuticas para favorecer la angiogénesis en general y específicamente para el tratamiento de la disfunción eréctil.

Fathke et al. (Stem Cells 2004; 22:812-822) han mostrado que después de una inyección de células madre de médula ósea en ratones, estas células madre colaboraban con la población de células de la piel regeneradas en condiciones normales. Se mostró además que las células madre de la médula ósea

contribuían en la regeneración de los fibroblastos dérmicos y transcribían colágeno de tipo I y III, siendo el colágeno de tipo III específico para estas células madre obtenidas a partir de la médula ósea. Las células madre fueron trasplantadas sistémicamente mediante inyección en el torrente sanguíneo de un animal diferente al donante o directamente en la médula ósea del receptor. No se mostró una mejora en la calidad o la velocidad de la curación.

En la publicación de Bang O.Y et al., Ann Neurology 2005, junio; 57(6): 874-82, se describe el trasplante de células madre mesenquimatosas autólogas que eran células mononucleares de la médula ósea, para el tratamiento de accidentes cerebrovasculares isquémicos. Estas células se separaron mediante separación de la médula ósea por densidad en Ficoll y se cultivaron y se expandieron antes de la reimplantación. Además no expresaban CD34 o CD45. No se observó ninguna mejoría funcional después del tratamiento.

En la publicación de Mazzini et al., (The Lancet 2004; 354: 1936-1937), se describe el trasplante en la médula espinal de células madre mesenquimatosas autólogas para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica. Los resultados descritos solo mostraron una ralentización de la disminución de la capacidad vital forzada de algunos pacientes, pero no una mejoría.

Compendio de la invención

El Solicitante ha descubierto un nuevo método de extracción y separación de células de la médula ósea que permite incrementar su potencia terapéutica. Las células extraídas por este método son capaces de regenerar in vivo la piel, los vasos sanguíneos, el sistema nervioso y el músculo cardiaco.

Por lo tanto, la invención se refiere a:

1. Un procedimiento para la separación de células de la médula ósea que comprende las etapas de:

a) centrifugar la médula ósea;

b) recoger la capa leucocitaria formada después de la etapa a);

c) centrifugar la capa leucocitaria obtenida en la etapa b); y

d) recoger la capa leucocitaria formada después de la etapa c).

2. El procedimiento para la separación de células de la médula ósea según el punto 1, en el que las etapas a) y c), se llevan a cabo a 1500 G.

3. El procedimiento para la separación de células de la médula ósea de acuerdo con el punto 1 o 2, en el que las etapas a) y c) se llevan a cabo a 18°C.

4. El procedimiento para la separación de células de la médula ósea de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que la etapa a) se lleva a cabo durante al menos aproximadamente 20 minutos y la etapa c) se lleva a cabo durante al menos aproximadamente 10 minutos, preferiblemente hasta 20 minutos y más preferiblemente durante al menos aproximadamente 20 minutos.

5. El procedimiento para la separación de células de la médula ósea de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, en el que en la etapa b) los glóbulos rojos por debajo de la capa leucocitaria se recogen con la capa leucocitaria, y el volumen de glóbulos rojos recogidos está entre 1 a 20 veces, preferiblemente 1 a 10 veces, más preferiblemente 2 a 5 veces e incluso más preferiblemente 5 veces, el de la capa leucocitaria.

6 El procedimiento para la separación de células de la médula ósea de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores, que comprende etapas adicionales entre la etapa b) y c), que comprenden las etapas

de:

b1) recoger un volumen de glóbulos rojos por debajo del volumen recogido en la etapa b), en el que el volumen de glóbulos rojos recogidos está entre 1 a 20 veces, preferiblemente 1 a 10 veces, más preferiblemente 2 a 5 veces e incluso más preferiblemente 5 veces, el de la capa leucocitaria;

c1) centrifugar el volumen de glóbulos rojos recogidos en la etapa b1);

d 1) recoger la capa leucocitaria formada después de la etapa c1); y

e1) mezclar la capa leucocitaria recogida después de la etapa d1) con la capa leucocitaria recogida después de la etapa c).

7. La capa leucocitaria obtenible mediante el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los puntos anteriores.

8. La capa leucocitaria según el punto 7, en la que las células contenidas en la capa leucocitaria expresan CD 45 o CD 34.

9. Las células de la capa leucocitaria obtenidas a partir de la médula ósea de acuerdo con cualquiera de los puntos 7 o 8.

10. Las células de acuerdo con el punto 9, en donde las células son células madre.

11. Las células de acuerdo con los puntos 9 o 10, en donde las células expresan CD 45 o CD 34.

1. Un procedimiento para la separación de células de la médula ósea que comprende las etapas de:

a) centrifugar la médula ósea;

b) recoger la capa leucocitaria formada después de la etapa a) con un volumen de glóbulos rojos por debajo de la capa leucocitaria, el volumen de glóbulos rojos recogido es 1 a 20 veces, preferentemente 1 a 10 veces, más preferentemente 2 a 5 veces e incluso más preferentemente 5 veces el de la capa leucocitaria;

c) centrifugar la capa leucocitaria con el volumen de glóbulos rojos por debajo de la capa leucocitaria, obtenida en la etapa b); y

d) recoger la capa leucocitaria formada después de la etapa c).

2. El procedimiento para la separación de células de la médula ósea según la reivindicación 1, en el que las etapas a) y c), se llevan a cabo a 1500 G.

3. El procedimiento para la separación de células de la médula ósea según la reivindicación 1 o 2, en el que las etapas a) y c) se llevan a cabo a 18°C.

4. El procedimiento para la separación de células de la médula ósea según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa a) se lleva a cabo durante al menos aproximadamente 20 minutos y la etapa c) se lleva a cabo durante al menos aproximadamente 10 minutos, preferiblemente hasta 20 minutos y más preferiblemente durante al menos aproximadamente 20 minutos.

5. El procedimiento para la separación de células de la médula ósea según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende etapas adicionales entre las etapas b) y c), que comprenden las etapas de:

b1) recoger un volumen de glóbulos rojos por debajo del volumen recogido en la etapa b), en el que el volumen de glóbulos rojos recogido está entre 1 a 20 veces, preferiblemente 1 a 10 veces, más preferiblemente 2 a 5 veces e incluso más preferiblemente 5 veces, el de la capa leucocitaria;

c1) centrifugar el volumen de glóbulos rojos recogido en la etapa b1);

d1) recoger la capa leucocitaria formada después de la etapa c1); y

e1) mezclar la capa leucocitaria recogida después de la etapa d 1) con la capa leucocitaria recogida después de la etapa c).

6. La capa leucocitaria obtenida al recoger la capa leucocitaria formada después de la etapa c) del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. La capa leucocitaria según la reivindicación 6, en la que las células contenidas en la capa leucocitaria expresan CD 45 o CD 34.

8. La capa leucocitaria según la reivindicación 7, en la que las células son células madre.

9. La capa leucocitaria según las reivindicaciones 7 u 8, en la que las células expresan CD 45 o CD

34.

10. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que las células son de la estirpe hematopoyética o mesenquimatosa.

11. La capa leucocitaria según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la que la concentración de las células es de 20-200 millones por 2 a 10 mi, y en donde 2-20 millones de esas 20- 200 millones de células expresan CD 34.

12. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para su uso en terapia.

13. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para su uso en la

regeneración de tejidos.

14. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para su uso en el tratamiento terapéutico de una enfermedad o una lesión del sistema nervioso central.

15. La capa leucocitaria según la reivindicación 14, para el uso según la reivindicación 14, en donde la enfermedad o la lesión se selecciona entre el grupo que consiste en lesión de la médula espinal,

esclerosis múltiple, accidente vascular cerebral y esclerosis lateral amiotrófica.

16. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para su uso en la curación de una herida de la piel.

17. La capa leucocitaria según la reivindicación 16, en donde la herida de la piel se selecciona entre el grupo que consiste en heridas de la piel a consecuencia de diabetes, úlceras, intervención quirúrgica,

cirugía estética y quemaduras.

18. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para su uso para favorecer la angiogénesis.

19. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para su uso en el tratamiento de una disfunción eréctil.

20. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para su uso en el

tratamiento de la diabetes de tipo 1 o de tipo 2.

21. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para su uso en el tratamiento de la artritis.

22. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para su uso en el 20 tratamiento de una lesión hepática.

23. La capa leucocitaria según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para su uso en el tratamiento de la incontinencia urinaria.

24. La capa leucocitaria según las reivindicaciones 12 a 23, en donde la capa leucocitaria es autóloga.