Aparato y método de amplificación de ácido nucleico.

Aparato para amplificación y medición de un ácido nucleico deseado en muestras de medición derivadas de un organismo vivo,

incluyendo:

una unidad (101) para amplificar el ácido nucleico deseado en una muestra de medición preparada a partir del organismo vivo, y medir un producto de la amplificación del ácido nucleico deseado;

una unidad (101) para obtener un valor de medición relacionado con una cantidad del producto de la amplificación; caracterizado el aparato por

una unidad para determinar (102d) si la amplificación del ácido nucleico deseado es inhibida en base a un primer valor de medición obtenido de una primera muestra de medición, y un segundo valor de medición obtenido de una segunda muestra de medición que tiene una relación de dilución más alta en comparación con la primera muestra de medición, donde la unidad (102d) es para determinar que la amplificación es inhibida cuando una cantidad del segundo producto en base al segundo valor de medición es mayor que la del primer producto en base al primer valor de medición, o

para determinar que la amplificación del ácido nucleico deseado es inhibida cuando el primer valor de medición y el segundo valor de medición no son proporcionales a las relaciones de dilución de la primera muestra de medición y la segunda muestra de medición;

y donde dicho aparato incluye una unidad de análisis (102d) para determinar si el ácido nucleico deseado en la muestra de medición derivada de un organismo vivo se expresa excesivamente en base a una comparación entre un valor umbral y el primer valor de medición cuando la unidad de determinación (102d) determina que no hay inhibición de amplificación, o

para determinar si el ácido nucleico deseado en una muestra biológica se expresa excesivamente en base a una comparación entre un segundo valor umbral y el segundo valor de medición cuando la unidad de determinación (102d) determina que hay inhibición de amplificación.

Aparato y método de amplificación de ácido nucleico Campo de la invención La presente invención se refiere a un aparato y método de amplificación de ácido nucleico y más en concreto, a un aparato y método de amplificación de ácido nucleico capaces de amplificar y medir un ácido nucleico deseado en una muestra derivada de un organismo vivo.

Antecedentes En los últimos años, la prueba genética se ha venido usando rápida y ampliamente en el campo del diagnóstico clínico. Con la prueba genética, los ácidos nucleicos y los cromosomas son analizados para poder examinar la presencia o ausencia de variaciones y formas nucleares asociadas con trastornos hereditarios a efectos clínicos. Como un ejemplo de prueba genética se menciona el diagnóstico de metástasis de células cancerosas a nodos linfáticos. Las células cancerosas dejan tumor primario y se difunden por metástasis por todo el cuerpo del paciente mediante los vasos sanguíneos y conductos linfáticos. En la operación de un cáncer, las lesiones se deberán quitar con la mayor seguridad posible, y por lo tanto, la metástasis deberá ser detectada exactamente y se deberá dar tratamientos apropiados dependiendo del grado de metástasis. En este sentido, el diagnóstico de metástasis de células cancerosas a nodos linfáticos realizado durante la operación tiene un significado sumamente importante. Como uno de los métodos de diagnóstico de metástasis de células cancerosas a nodos linfáticos, se conoce un método en el que ácido nucleico de una proteína, que no se expresa en células normales o cuyo nivel de expresión es bajo, pero que se expresa mucho en células cancerosas, es detectado como un ácido nucleico deseado. Gracias al avance de la tecnología de análisis genético realizado en estos años, ahora es posible realizar diagnóstico de cáncer efectivamente detectando un ácido nucleico deseado contenido en el tejido de nodo linfático reseccionado del organismo vivo mediante amplificación.

Como se ha mencionado anteriormente, cuando se desea determinar si hay metástasis de células cancerosas a nodos linfáticos por amplificación de ácido nucleico deseado, se lleva a cabo amplificación de ácidos nucleicos deseados en una muestra de medición usando una muestra de medición que se prepara de tal manera que los nodos linfáticos sean homogenizados y los ácidos nucleicos deseados sean extraídos a una solución y purificados. Sin embargo, con este método, existe el inconveniente de que la purificación del ácido nucleico deseado precisa un tiempo considerable, tarda más tiempo antes de que los resultados de la determinación por amplificación del ácido nucleico deseado estén disponibles, y es difícil realizar rápidamente el diagnóstico de metástasis de células cancerosas por amplificación del ácido nucleico deseado. En el diagnóstico de metástasis de células cancerosas a nodos linfáticos durante la operación, la estrategia de tratamiento en la operación se determina según los resultados de la determinación de metástasis de células cancerosas, y por lo tanto, la rápida determinación de metástasis es tan importante.

Desde los puntos de vista mencionados anteriormente, si una solución en la que los nodos linfáticos están homogenizados o se usa supernadante de esta solución como la muestra de medición sin efectuar extracción y purificación del ácido nucleico al tiempo de la preparación de la muestra de medición, es posible realizar mediciones del ácido nucleico deseado de forma rápida. Sin embargo, cuando el ácido nucleico deseado es amplificado usando dicha muestra de medición, existe el problema de que, en comparación con un caso donde la amplificación de ácidos nucleicos se realiza usando una muestra de medición preparada por purificación del ácido nucleico, la cantidad de sustancias inhibidoras que evitan la amplificación del ácido nucleico deseado derivado de nodos linfáticos aumenta y así no se puede obtener resultados exactos de la medición.

Con el fin de superar este problema, convencionalmente, se conoce un método en el que se estima la amplificación de un ácido nucleico deseado usando una sonda de ácido nucleico que hibridiza al ácido nucleico deseado (véase, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente japonesa número 2004-203) . Según el método descrito en la publicación de la solicitud de patente japonesa número 2004-203, un ácido nucleico (ácido nucleico estándar interno) en el que la secuencia base del ácido nucleico deseado se muta en parte, se añade a un sistema de medición en una concentración conocida, y al mismo tiempo, una sonda de ácido nucleico deseado que hibridiza específicamente al ácido nucleico deseado y una sonda de ácido nucleico estándar interno que hibridiza específicamente al ácido nucleico estándar interno se añaden al sistema de medición, el ácido nucleico deseado y el ácido nucleico estándar interno se miden entonces a la vez usando el método PCR, y el ácido nucleico deseado se mide a partir de una cantidad de adición del ácido nucleico estándar interno.

Sin embargo, con el método para medir el ácido nucleico deseado descrito en dicha publicación de la solicitud de patente japonesa número 2004-203, el ácido nucleico estándar interno no exhibe necesariamente la misma reactividad que el ácido nucleico deseado, y por lo tanto, surge el problema de que la medición exacta del ácido nucleico deseado es difícil.

La técnica anterior también incluye la solicitud de patente EP 1508809 A1, que describe un aparato para

amplificación incluyendo una unidad de determinación. Además, Dumonceaux y colaboradores, “Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantiative PCR based on the chaperonin-60 target”, Journal of Microbiological Methods 64 (1) :46-62 describe un método para evitar que los inhibidores PCR copurificados deterioren los límites de detección en un ensayo qPCR de muestras de ADN de poblaciones bacterianas, incluyendo plantilla endógena de amplificación en una serie de dilución del extracto de ADN.

Resumen El alcance de la presente invención se define únicamente por las reivindicaciones anexas, y no queda afectado en ningún grado por lo expresado en este resumen.

Un aparato de amplificación de ácido nucleico según un primer aspecto de la presente invención es un aparato de amplificación de ácido nucleico para amplificar un ácido nucleico deseado derivado de organismo vivo, incluyendo: una unidad de medición para amplificar el ácido nucleico deseado en una muestra de medición preparada a partir del organismo vivo, y medir un producto de la amplificación del ácido nucleico deseado; una unidad de obtención de valor de medición para obtener un valor de medición relacionado con una cantidad del producto de la amplificación; y una unidad de determinación para determinar si la inhibición de amplificación del ácido nucleico deseado tiene lugar o no en base a un primer valor de medición y un segundo valor de medición, teniendo el primer valor de medición obtenido de una primera muestra de medición y el segundo valor de medición obtenido de una segunda muestra de medición una relación de dilución diferente de la primera muestra de medición.

Un método de amplificación de ácido nucleico según un segundo aspecto de la presente invención es un método de amplificación de ácido nucleico para amplificar un ácido nucleico deseado derivado de organismo vivo, incluyendo los pasos de: amplificar el ácido nucleico deseado en una primera muestra de medición preparada a partir del organismo vivo; amplificar el ácido nucleico deseado en una segunda muestra de medición preparada a partir del organismo vivo y que tiene una relación de dilución diferente de la primera muestra de medición; medir un primer producto de la amplificación del ácido nucleico deseado de la primera muestra de medición; medir un segundo producto de la amplificación del ácido nucleico deseado de la segunda muestra de medición; obtener un primer valor de medición relacionado con una cantidad del primer producto de la amplificación; obtener un segundo valor de medición relacionado con una cantidad del segundo producto de la amplificación; y determinar si la inhibición de amplificación del ácido nucleico deseado tiene lugar o no en base al primer valor de medición y el segundo valor de medición.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 es una ilustración en perspectiva que muestra toda la composición de un sistema de amplificación y análisis de genes de una realización según la presente invención.

La figura 2 es una ilustración en perspectiva que muestra toda la composición de un aparato de medición... [Seguir leyendo]

1. Aparato para amplificación y medición de un ácido nucleico deseado en muestras de medición derivadas de un organismo vivo, incluyendo:

una unidad (101) para amplificar el ácido nucleico deseado en una muestra de medición preparada a partir del organismo vivo, y medir un producto de la amplificación del ácido nucleico deseado;

una unidad (101) para obtener un valor de medición relacionado con una cantidad del producto de la amplificación;

caracterizado el aparato por

una unidad para determinar (102d) si la amplificación del ácido nucleico deseado es inhibida en base a un primer valor de medición obtenido de una primera muestra de medición, y un segundo valor de medición obtenido de una segunda muestra de medición que tiene una relación de dilución más alta en comparación con la primera muestra de medición, donde la unidad (102d) es para determinar que la amplificación es inhibida cuando una cantidad del segundo producto en base al segundo valor de medición es mayor que la del primer producto en base al primer valor de medición, o para determinar que la amplificación del ácido nucleico deseado es inhibida cuando el primer valor de medición y el segundo valor de medición no son proporcionales a las relaciones de dilución de la primera muestra de medición y la segunda muestra de medición;

y donde dicho aparato incluye una unidad de análisis (102d) para determinar si el ácido nucleico deseado en la muestra de medición derivada de un organismo vivo se expresa excesivamente en base a una comparación entre un valor umbral y el primer valor de medición cuando la unidad de determinación (102d) determina que no hay inhibición de amplificación, o para determinar si el ácido nucleico deseado en una muestra biológica se expresa excesivamente en base a una comparación entre un segundo valor umbral y el segundo valor de medición cuando la unidad de determinación (102d) determina que hay inhibición de amplificación.

2. El aparato según la reivindicación 1, incluyendo además una unidad de salida para enviar información relacionada con el resultado de la determinación por la unidad de determinación (102d) .

3. El aparato según la reivindicación 1, incluyendo además una unidad de salida (102c) para enviar información relativa al resultado de la determinación por la unidad de análisis.

4. El aparato según la reivindicación 1, incluyendo además una unidad de salida (102c) para enviar positivo o negativo en base al resultado de la determinación relativo a la expresión de exceso.

5. El aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, incluyendo además:

una parte de colocación de muestra para poner un primer recipiente y un segundo recipiente, alojando el primer recipiente la primera muestra de medición y alojando el segundo recipiente la segunda muestra de medición; y

una unidad dispensadora para dispensar la primera muestra de medición del primer recipiente a un primer recipiente de reacción en la unidad para amplificar y dispensar la segunda muestra de medición del segundo recipiente a un segundo recipiente de reacción en la unidad para amplificación.

6. El aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, incluyendo además:

una parte de colocación de muestra para poner un primer recipiente y un segundo recipiente, donde el primer recipiente es para acomodar una muestra pretratada que se prepara a partir de un organismo vivo y un líquido de pretratamiento y contiene ácido nucleico solubilizado en el líquido de pretratamiento, y el segundo recipiente es para acomodar un líquido de dilución; y

una unidad dispensadora para dispensar la muestra pretratada del primer recipiente a un primer recipiente de reacción y un segundo recipiente de reacción en la unidad para medición y dispensar el líquido de dilución del segundo recipiente al segundo recipiente de reacción.

7. Un método para amplificación y medición de un ácido nucleico deseado en muestras de medición preparadas a partir de un organismo vivo, incluyendo los pasos de:

(a) amplificar el ácido nucleico deseado en una primera muestra de medición preparada a partir del organismo vivo;

(b) amplificar el ácido nucleico deseado en una segunda muestra de medición preparada a partir del organismo vivo y que tiene una relación de dilución más alta en comparación a la primera muestra de medición;

(c) obtener un primer valor de medición relacionado con una cantidad del primer producto generado amplificando el 5 ácido nucleico deseado en la primera muestra de medición;

(d) obtener un segundo valor de medición relacionado con una cantidad del segundo producto generado amplificando el ácido nucleico deseado en la segunda muestra de medición; y

(e) determinar que la amplificación del ácido nucleico deseado es inhibida cuando el segundo valor de medición es mayor que el primer valor de medición;

incluyendo además:

(f) determinar si el ácido nucleico deseado se expresa excesivamente en base a una comparación entre un valor umbral y el primer valor de medición cuando el resultado de la determinación (e) es no aparición de inhibición de amplificación; o (g) determinar si el ácido nucleico deseado se expresa excesivamente en base a una comparación entre un segundo valor umbral y el segundo valor de medición cuando el resultado de la determinación (e) es aparición de inhibición de amplificación.

8. El método según la reivindicación 7, incluyendo además el paso de enviar información relativa al resultado de la determinación. 25

9. El método según la reivindicación 7, incluyendo además un paso de enviar positivo o negativo en base al resultado de la determinación relativo a la expresión de exceso.