Anticuerpos monoclonales humanos contra CD20.

Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une un epítopo en CD20,

cuyo epítopo no comprende o requiere los restos aminoacídicos de alanina en la posición 170 o de prolina en la posición 172, pero que requiere los restos aminoacídicos de asparagina en la posición 163 y de asparagina en la posición 166

Anticuerpos monoclonales humanos contra CD20 Antecedentes de la invención

La molécula CD20 (también llamado antlgeno de diferenciación restringido a linfocitos B humanos o Bp35) es una proteína transmembrana hidrófoba con un peso molecular de aproximadamente 35 kD localizada en linfocitos B maduros y pre linfocitos B (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(19): 11282-11287; y Einfield et al. (1988) EMBO J. 7(3): 711 -717). CD20 se encuentra en la superficie de más del 90 % de linfocitos B de sangre periférica u órganos linfoides y se expresa durante el desarrollo de prelinfocitos B temprano y permanece hasta la diferenciación de células plasmáticas. CD20 está presente tanto en linfocitos B normales como en linfocitos B malignos. En particular, CD20 se expresa en más del 90 % de linfomas no de Hodgkin de linfocitos B (NHL) (Anderson et al. (1984) Blood 63(6): 1424-1433), pero no se encuentra en células madre hematopoyéticas, prolinfocitos B, células plasmáticas normales u otros tejidos normales (Tedder et al. (1985) J. Immunol. 135(2): 973-979).

La región carboxilo terminal de 85 aminoácidos de la proteína CD20 se localiza dentro del citoplasma. La longitud de esta región contrasta con la de otras estructuras de superficie específicas de linfocitos B tales como cadenas pesadas de IgM, IgD e IgG o cadenas a o (5 de antígenos de histocompatibilidad de clase II, que tienen regiones intracitoplásmicas relativamente cortas de 3, 3, 28, 15 y 16 aminoácidos, respectivamente (Komaromy et al. (1983) NAR 11: 6775-6785). De los últimos 61 aminoácidos carboxilo terminales, 21 son restos ácidos, mientras que solamente 2 son básicos, lo que indica que esta región tiene una fuerte carga neta negativa. El N° de Acceso de GenBank es NP_690605.

Se cree que CD20 podría estar implicada en la regulación de una etapa o etapas tempranas en el proceso de activación y diferenciación de linfocitos B (Tedder et al. (1986) Eur. J. Immunol. 16: 881-887) y podría actuar como un canal iónico de calcio (Tedder ef al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D: 195).

A pesar de la incertidumbre acerca de la función real de CD20 en la promoción de la proliferación y/o diferenciación de linfocitos B, esta proporciona una importante diana para terapia mediada por anticuerpos para controlar o destruir linfocitos B implicados en cánceres y trastornos autoinmunes. En particular, la expresión de CD20 en células tumorales, por ejemplo, NHL, la hace una diana importante para terapia mediada por anticuerpos para dirigir específicamente agentes terapéuticos contra células neoplásicas positivas para CD20. Sin embargo, aunque los resultados obtenidos hasta la fecha claramente establecen CD20 como una diana útil para inmunoterapia, también muestran que los anticuerpos murinos y quiméricos disponibles en la actualidad no constituyen agentes terapéuticos ideales.

En consecuencia, existe la necesidad de anticuerpos terapéuticos mejorados contra CD20 que sean eficaces en la prevención y/o tratamiento de una serie de enfermedades que implican células que expresan CD20.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a un epítopo en CD20, cuyo epítopo no comprende o requiere los restos aminoacídicos de alanina en la posición 170 o prolina en la posición 172, pero requiere los restos aminoacídicos de asparagina en la posición 163 y asparagina en la posición 166.

La presente invención proporciona de este modo agentes terapéuticos de anticuerpos mejorados para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas con células que expresan CD20, incluyendo enfermedades relacionadas con tumores y enfermedades inmunes, incluyendo enfermedades autoinmunes. Los anticuerpos abarcados por la invención están mejorados porque son completamente humanos, y, por lo tanto, son potencialmente menos inmunogénicos en pacientes.

Como se ejemplifica en este documento, los anticuerpos humanos de la invención median en la destrucción de linfocitos B que expresan CD20 por una diversidad de mecanismos. En una realización, los anticuerpos humanos de la invención inducen citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), por ejemplo, al menos 20 % de lisis mediada por CDC, preferiblemente aproximadamente 30 % de lisis mediada por CDC, y más preferiblemente 40-50 % de lisis mediada en células, tales como células de leucemia linfocítica B crónica (B-CLL). En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención inducen apoptosis de células que expresan CD20. En otra realización, los anticuerpos

humanos de la invención inducen adhesión homotípica de células que expresan CD20. Además, los anticuerpos

humanos de la invención pueden inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) de células que

expresan CD20 en presencia de células efectoras humanas (por ejemplo, monocitos, células mononucleares,

linfocitos NK y PMN). Además, los anticuerpos humanos de la invención pueden inducir fagocitosis de células que expresan CD20 en presencia de macrófagos. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden actuar por uno o más de estos mecanismos. Los ejemplos de células que pueden destruirse por anticuerpos humanos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, linfocitos B que expresan CD20, tales como linfocitos B

tumorigénicos y linfocitos B implicados en enfermedades inmunes. En una realización particular, los anticuerpos humanos se usan para mediar en la destrucción de linfocitos B en el tratamiento de linfoma, por ejemplo, linfoma no de Hodgkin de linfocitos B.

Los anticuerpos humanos de la Invención incluyen anticuerpos lgG1 (por ejemplo, lgG1 ,k), lgG3 (por ejemplo, lgG3,K) e lgG4 (por ejemplo, lgG4,K). Sin embargo, otros isotipos de anticuerpo están abarcados por la invención, incluyendo lgG2, IgM, IgAl, lgA2, IgA secretora, IgD e IgE. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos completos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab)2, Fv, Fv de cadena sencilla o anticuerpos blespecíflcos. Además, los fragmentos de unión a antígeno incluyen proteínas de fusión de inmunoglobullna de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión (tal como una región variable de cadena pesada o una reglón variable de cadena ligera) que se fusiona con un polipéptido de región bisagra de inmunoglobulina, (¡i) una región constante CFI2 de cadena pesada de ¡nmunoglobulina fusionada con la región bisagra, y (¡ü) una región constante CFI3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región constante CH2. Tales proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen adicionalmente en los documentos US 2003/0118592 y US 2003/0133939.

Los anticuerpos humanos particulares de la presente invención incluyen los denominados 2F2 y 7D8, codificados por ácidos nucleicos de cadena pesada humana y cadena ligera kappa humana que comprenden secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se expone en SEC ID N°: 1 ó 5 y SEC ID N°: 3 ó 7, respectivamente. En otra realización, los anticuerpos humanos se caracterizan por tener regiones variables de cadena pesada humana y cadena ligera kappa humana que comprenden las secuencias de aminoácidos que se exponen en SEC ID N°: 2 ó 6 y SEC ID N°: 4 u 8, respectivamente.

Los anticuerpos humanos pueden tener regiones variables de cadena ligera kappa humana y cadena pesada humana que son al menos 90 % homologas, preferiblemente al menos 95 % homologas y más preferiblemente al menos 98 % o al menos 99 % homologas de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEC ID N°: 2 y SEC ID N°: 4, respectivamente; o SEC ID N°: 6 y SEC ID N°: 8, respectivamente.

Otros anticuerpos humanos particulares de la invención incluyen aquellos que comprenden una región CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID NO: 15 y opcionalmente una región CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID NO: 18.

Otros anticuerpos particulares de la invención comprenden:

(i) las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nos: 13, 14 y 15 o en las SEC ID Nos: 19, 20 y 15; y

(¡i) las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nos: 16, 17 y 18.

También se incluyen dentro de la presente invención anticuerpos que se disocian de CD20 con una constante de disociación en equilibrio (KD) de aproximadamente 1-10 nM. Tales anticuerpos también incluyen los que no reaccionan de forma cruzada con antígenos de superficie celular relacionados... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une un epítopo en CD20, cuyo epftopo no comprende o requiere los restos aminoacfdicos de alanina en la posición 170 o de prolina en la posición 172, pero que requiere los restos aminoacfdicos de asparagina en la posición 163 y de asparagina en la posición 166.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una región CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID N°: 15.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, que comprende una región CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID N°: 18.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:

(i) las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID Nos: 13, 14 y 15 o en las SEC ID Nos: 19, 20 y 15; y

(ii) las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEC ID N°: 16, 17 y 18.

5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que:

(i) es un anticuerpo lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgA secretora, IgD o IgE y está opcionalmente intacto y glucosilado en una célula eucariota;

(ii) es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario; o

(iii) es una proteína de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprende (i) un polipéptido de dominio de unión en forma de una región variable de cadena pesada o región variable de cadena ligera que comprende las secuencias aminoacídicas como se expone en la SEC ID N°: 2 y SEC ID N°: 4, respectivamente, o las secuencias aminoacídicas como se expone en la SEC ID N°: 6 y SEC ID N°: 8, respectivamente, que se fusiona a un polipéptido de región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región bisagra, y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región constante CH2.

6. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une a CD20 humano y que se expresa por una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende las secuencias de nucleótidos de cadena pesada variable y cadena ligera variable como se expone en la SEC ID N°: 1 y SEC ID N°: 3, respectivamente, o como se expone en la SEC ID N°: 5 y SEC ID N°: 7, respectivamente.

7. Un método de producción de un anticuerpo monoclonal humano que se une a CD20 humano, comprendiendo el método expresar un anticuerpo en una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que comprende las secuencias de nucleótidos de cadena pesada variable y cadena ligera variable como se expone en la SEC ID N°: 1 y SEC ID N°: 3, respectivamente, o como se expone en la SEC ID N°: 5 y SEC ID N°: 7, respectivamente, y aislar el anticuerpo de las células.

8. Un transfectoma que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, en el que el transfectoma produce una cantidad detectable del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de una cadena ligera, cadena pesada o las cadenas tanto ligera como pesada del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y opcionalmente la región constante de una cadena ligera, cadena pesada o las cadenas tanto ligera como pesada del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Una composición que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente comprendiendo también un agente terapéutico, tal como un agente citotóxico, un agente radiotóxico, un inmunosupresor, un agente inmunomodulador, tal como una citoquina o una quimiocina, doxorubicina, cisplatino, bleomicina, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida, anticuerpos anti-CD25, anticuerpos anti-CD19, anticuerpos anti-CD21, anticuerpos anti-CD22, anticuerpos anti-CD37, anticuerpos anti- CD38, anticuerpos anti-lL6R, anti-lL8, anticuerpos anti-IL15, anticuerpos anti-lL15R, anticuerpos anti-CD4, anticuerpos ant¡-CD11a, anticuerpos anti-alfa-4/beta-1 integrina (VLA4), anticuerpos CTLA4-lg y anti-C3b(i).

11. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 unido a un agente citotóxico, un radioisótopo o un fármaco.

12. Un anticuerpo humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una composición de acuerdo con la reivindicación 10 o un inmunoconjugado de acuerdo con la reivindicación 11 para su uso en un método de tratamiento o prevención de un linfoma de linfocitos B, linfoma no de Hodgkin de linfocitos B,

linfoma/leucemia linfoblástica de linfocitos B precursores y neoplasia de linfocitos B maduros, tal como leucemia linfocítica crónica (CLL)/llnfoma linfocítico pequeño (SLL) de linfocitos B, leucemia prollnfocítica de linfocitos B, llnfoma llnfoplasmacítlco, llnfoma de células de manto (MCL), llnfoma folicular (FL), linfoma del centro folicular cutáneo, llnfoma de linfocitos B de zona marginal (tipo MALÍ, nodal y tipo esplénico), tricoleucemia, llnfoma de linfocitos B grandes difuso, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postrasplante, macroglobulinemia de Waldenstróm o linfoma de células grandes anaplásico (ALCL), granulomatosis linfomatoide, linfoma de efusión primaria, linfoma de linfocitos B grandes intravascular, linfoma de linfocitos B grandes mediastinal, enfermedades de cadena pesada (incluyendo enfermedad y, fi y a), linfomas inducidos por terapia con agentes inmunosupresores, tales como linfoma inducido por ciclosporina y linfoma inducido por metotrexato, psoriasis, artritis psoriásica, dermatitis, esclerodermia sistémica y esclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de dificultad respiratoria, meningitis, encefalitis, uveítis, glomerulonefritis, eccema, asma, aterosclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, diabetes de aparición juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behget, nefritis de complejo inmune, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, trombocitopenias mediadas por el sistema inmune, tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide (RA), dermatitis atópica, pénfigo, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiencia renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, enfermedades asociadas con virus del herpes y VIH.

13. El uso de un anticuerpo humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una composición de acuerdo con la reivindicación 10 o un inmunconjugado de acuerdo con la reivindicación 11, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un linfoma de linfocitos B, linfoma no de Hodgkin de linfocitos B, linfoma/leucemia linfoblástica de linfocitos B precursores y neoplasia de linfocitos B maduros, tal como leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítico pequeño (SLL) de linfocitos B, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células de manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma del centro folicular cutáneo, linfoma de linfocitos B de zona marginal (tipo MALÍ, nodal y tipo esplénico), tricoleucemia, linfoma de linfocitos B grandes difuso, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postrasplante, macroglobulinemia de Waldenstróm o linfoma de células grandes anaplásico (ALCL), granulomatosis linfomatoide, linfoma de efusión primaria, linfoma de linfocitos B grandes intravascular, linfoma de linfocitos B grandes mediastinal, enfermedades de cadena pesada (incluyendo enfermedad y, p y a), linfomas inducidos por terapia con agentes inmunosupresores, tales como linfoma inducido por ciclosporina y linfoma inducido por metotrexato, psoriasis, artritis psoriásica, dermatitis, esclerodermia sistémica y esclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de dificultad respiratoria, meningitis, encefalitis, uveítis, glomerulonefritis, eccema, asma, aterosclerosis, deficiencia de adhesión de leucocitos, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjógren, diabetes de aparición juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behget, nefritis de complejo inmune, nefropatía de IgA, polineuropatías de IgM, trombocitopenias mediadas por el sistema inmune, tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis lúpica, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide (RA), dermatitis atópica, pénfigo, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegener, síndrome de Omenn, insuficiencia renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, enfermedades asociadas con virus del herpes y VIH.

14. El anticuerpo humano, composición o inmunoconjugado para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide (RA).

15. El anticuerpo humano, composición o inmunoconjugado para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la enfermedad es linfoma folicular (LF) o leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítico pequeño (SLL) de linfocitos B.

16. El uso de la reivindicación 13, en el que la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide (RA).

17. El uso de la reivindicación 13, en el que la enfermedad es linfoma folicular (LF) o leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma linfocítico pequeño (SLL) de linfocitos B.