Anticuerpos contra troponina I y métodos de uso de los mismos.

Línea celular de ovario de hámster chino (CHO), referida como TnI 19C7 AM1 hG1 CHO 204,

designada por la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de depósito PTA-9816.

Anticuerpos contra troponina I y métodos de uso de los mismos ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN

Campo de la presente invención

[1] La presente invención se refiere a anticuerpos contra troponina I, así como métodos de uso de los mismos. Información sobre antecedentes

[2] La troponina I es una proteína muscular que puede utilizarse en la determinación de daño miocárdico posterior o durante, por ejemplo, un infarto de miocardio. En particular, la troponina I es una de las tres subunidades del complejo de troponina que se encuentra en el filamento delgado del aparato contráctil muscular. Este complejo tiene un papel principal en el control del proceso de la contracción muscular. Las otros dos subunidades (es decir, T y C) también se inmovilizan en los miofilamentos delgados con troponina I en tejido muscular cadiaco, así como en tejido muscular esquelético.

[3] Se han descrito ensayos que miden la troponina I cardiaca en suero humano. Por ejemplo, se ha utilizado un radioensayo para este propósito (Cummins et al, Am Heart Journal 113: 1333-1344 (1987). Sin embargo, el ensayo utilizó anticuerpos policlonales que tienen una reactividad cruzada significativa con formas esqueléticas de troponina I. Además, se ha utilizado un ensayo de tipo sándwich que utiliza dos anticuerpos monoclonales diferentes (Bodar et al, Clinical Chemistry 38: 223-2214. (1992); véase también la Patente de Estados Unidos. N° 7.285.418). Desafortunadamente, dichos ensayos tienen un grado muy alto de imprecisión. De este modo, existe ciertamente la necesidad de inmunoensayos que sean altamente específicos y sensibles a la troponina I. Estos inmunoensayos también deben utilizar anticuerpos que no posean reactividad cruzada con troponina I hallada en el tejido esquelético. En particular, se necesitan dichos inmunoensayos de manera que se pueda utilizar la terapia apropiada por el médico a cargo, proporcionando así al paciente afectado el mejor pronóstico posible.

[4] En anticuerpo monoclonal 19C7 reconoce la troponina I cardiaca (Filatov V L et al., Biochemistry and Molecular Biology International 45: 1179-1187 (1998)). Se han desarrollado ensayos utilizando el anticuerpo Tnl 19C7 para la detección de Troponina I (Peronnet et al., Clínica Chimica Acta 377: 243-247 (26); solicitud de patente FR 2779526; y Katrukha et al., clinical Chemistry 44:12 (1998)).

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA PRESENTE INVENCIÓN

[5] La presente descripción se refiere a proteínas de unión, particularmente anticuerpos, capaces de unirse a la troponina I cardiaca. En particular, estos anticuerpos se unen a uno o más epítopos de la troponina I. Además, la presente descripción también proporciona métodos para producir y usar estas proteínas de unión o partes de las mismas, por ejemplo, en ensayos de diagnóstico.

[6] Adicionalmente, la presente descripción incluye una proteína de unión aislada que comprende un dominio de unión a antígeno que se une a la troponina I, comprendiendo dicho dominio de unión a antígeno al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: GYTFTDYNLH (SEQ ID NO: 52), YIYPYNGITGYNQKFKS (SEQ ID NO: 53), DAYDYDLTD (SEQ ID NO: 54), RTSKNVGTNIH (SEQ ID NO: 55), YASERLP (SEQ ID NO: 56) y QQSNNWPYT (SEQ ID NO: 57). La proteína de unión de la presente descripción puede incluir, por ejemplo, al menos 3 de estas CDRs. Además, esta proteína de unión puede comprender también un armazón o scaffold aceptor humano. Esta proteína de unión puede seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, una molécula de inmunoglobulina, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humanizado, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv unido a disulfuro, un scFv, un anticuerpo de dominio único, un diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo de doble especificidad, un anticuerpo anti-idiotípico, un anticuerpo biespecífico, o un fragmento de unión al epítopo funcionalmente activo de cualquiera de estas entidades.

[7] La presente descripción también abarca una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de unión, en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de la proteína de unión tiene al menos 7% de identidad con SEQ ID NO: 25 (véase la figura 12.). Esta molécula también puede comprender una cadena ligera variable que tiene una identidad de al menos el 7% con SEQ ID NO: 28 (ver la figura 12.).

[8] Además, la presente descripción incluye una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de unión, en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable de dicha proteína de unión es la SEQ ID

NO: 25.

[9] Adicionalmente, la presente descripción incluye una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de unión, en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de dicha proteína de unión es

la SEQ ID NO: 28. Esta molécula puede comprender además una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una cadena pesada variable, en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 25.

[1] La presente descripción también incluye un vector que comprende una o más de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, unido a un elemento regulador (por ejemplo, un promotor), así como una célula huésped que comprende este vector.

[11] Además, la presente descripción incluye un método para producir cualquiera de las proteínas de unión descritas anteriormente, capaces de unirse a la troponlna I, cuyo método comprende cultivar la célula huésped, descrita anteriormente, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para producir la proteína de unión de Interés. La descripción también Incluye la proteína de unión producida mediante este método.

[12] Además, la presente descripción abarca una composición farmacéutica que comprende uno cualquiera o más de las proteínas de unión descritas anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[13] Además, la presente descripción incluye un método de detección de antígeno de troponina I en una muestra de ensayo. Este método comprende las etapas de: poner en contacto la muestra de ensayo con un anticuerpo que se une a la troponina I y comprende la SEQ ID NO: 25 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos anticuerpo/antígeno; y detectar la presencia de los complejos, la presencia de los complejos que indican la presencia de antígeno de troponina I en dicha muestra de ensayo. El anticuerpo puede comprende además la SEQ ID NO: 28. El anticuerpo se puede producir por una línea celular de ovario de hámster chino que tiene la designación del depósito ATCC PTA-9816.

[14] La presente descripción también incluye un método de detección de antígeno de troponina I en una muestra de ensayo que comprende las etapas de: poner en contacto la muestra de ensayo con un primer anticuerpo que se une a la troponina I y comprende la SEQ ID NO: 25 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para la formación de complejos de primer anticuerpo/antígeno; añadir un conjugado a los complejos de primer anticuerpo/antígeno, en el que dicho conjugado comprende un segundo anticuerpo unido a un compuesto generador de señales capaz de generar una señal detectable, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos de primer anticuerpo/antígeno/segundo anticuerpo; y detectar la presencia de una señal que se genera por el compuesto generador de señales, indicando la presencia de la señal la presencia de antígeno de troponina I en dicha muestra de ensayo. El primer anticuerpo puede comprender además la SEQ ID NO: 28 y se puede producir por una línea celular de ovario de hámster chino que tiene la designación del depósito ATCC PTA-9816.

[15] Además, la presente descripción incluye un método de detección de antígeno de troponina I en una muestra de ensayo que comprende las etapas de: poner en contacto el antígeno de troponina I con un anticuerpo contra troponina I durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos de antígeno de troponina l/anticuerpo, en los que el anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 25 y está marcado con un compuesto generador de señales capaz de generar una señal detectable; añadir la muestra de ensayo a dichos complejos de antígeno de troponina l/anticuerpo durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos antígeno de troponina l/anticuerpo/antígeno de la muestra de ensayo con troponina I; y detectar la presencia de una señal que se genera por el compuesto generador de... [Seguir leyendo]

1. Línea celular de ovario de hámster chino (CHO), referida como Tnl 19C7 AM1 hG1 CHO 24, designada por la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de depósito PTA-9816.

2. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo producido por dicha línea celular de CHO, según la reivindicación 1.

3. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a Troponina I, que comprende una reglón VH y una región VL, en el que la región VH comprende:

CDR H1 que tiene la secuencia de aminoácidos GYTFTDYNLH SEQ ID NO: 52;

CDR H2 que tiene la secuencia de aminoácidos YIYPYNGITGYNQKFKS SEQ ID NO: 53; y CDR H3 que tiene la secuencia de aminoácidos DAYDYDYLTD SEQ ID NO: 54; y en el que la región VL comprende:

CDR L1 que tiene la secuencia de aminoácidos RTSKNVGTNIH SEQ ID NO: 55;

CDR L2 que tiene la secuencia de aminoácidos YASERLP SEQ ID NO: 56; y CDR L3 que tiene la secuencia de aminoácidos QQSNNWPYT SEQ ID NO: 57.

4. Anticuerpo o fragmento, según la reivindicación 3, en el que la secuencia de aminoácidos de la reglón VH tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y la secuencia de aminoácidos de la región VL tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

5. Anticuerpo o fragmento, según la reivindicación 3 ó 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento se selecciona del grupo que consiste en: una molécula de inmunoglobulina, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humanizado, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv unido a disulfuro, un scFv, un anticuerpo de dominio único, un diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo de doble especificidad, un anticuerpo anti-idiotípico, un anticuerpo biespecífico, y un fragmento de unión a epítopo funcionalmente activo de los mismos.

6. Anticuerpo o fragmento, según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que dicho anticuerpo o fragmento está unido de manera funcional a un marcador detectable.

7. Anticuerpo o fragmento, según la reivindicación 6, en el que dicho marcador detectable se selecciona entre un compuesto fluorescente, una enzima detectable, biotina, un material luminiscente y un material radioactivo.

8. Célula huésped que comprende uno o más vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o fragmento, según cualquiera de las reivindicaciones 3-6.

9. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento, según cualquiera de las reivindicaciones 2- 7, y un portador farmacéuticamente aceptable.

1. Kit que comprende un recipiente que contiene el anticuerpo o fragmento, según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 5.

11. Uso del anticuerpo o fragmento, según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, para detectar troponina I en una muestra biológica obtenida de un paciente.

12. Uso, según la reivindicación 11, en el que el uso comprende poner en contacto dicha muestra biológica con dicho anticuerpo o fragmento, y detectar dicho anticuerpo o fragmento unido a troponina I.

13. Uso, según la reivindicación 12, en el que el uso comprende:

a) recubrir uno o más de dichos anticuerpos o fragmentos sobre una fase sólida;

b) poner en contacto la muestra biológica con la fase sólida; y

c) detectar la troponina I unida a dichos anticuerpos o fragmentos sobre la fase sólida.

14. Uso, según la reivindicación 13, en el que la troponina se detecta mediante:

a) adición de un segundo anticuerpo, que se une a la troponina I, y que está unido a un compuesto generador de señales; y

b) detección de la presencia de una señal generada por dicho compuesto generador de señales, en la que la presencia de dicha señal indica la presencia de troponina I.

15. Uso, según la reivindicación 13 ó 14, en el que la fase sólida se selecciona del grupo que consiste en:

material poroso, material no poroso, una partícula de látex, una partícula magnética, una mlcropartícula, una microesfera, una membrana, un pocilio de mlcrotltulación y un tubo de plástico.

16. Uso, según la reivindicación 11, en el que el uso comprende:

a) poner en contacto dicha muestra biológica con 1) un antígeno de referencia de troponina I, en el que dicho antígeno está unido a un compuesto generador de señales capaz de generar una señal detectable y 2) dicho anticuerpo o fragmento; y

b) detectar una señal generada por dicho compuesto generador de señales, en el que la cantidad de antígeno de 5 troponina I detectado en dicha muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno de

referencia de troponina I unido a dicho anticuerpo.

17. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 11-16, en el que la muestra biológica es plasma, orina, sangre completa, sangre completa seca, suero, fluido cefalorraquídeo, saliva, lágrimas, lavados nasales o extractos acuosos

de tejidos y células.

18. Anticuerpo o fragmento, según cualquiera de las reivindicaciones 2-8, para usar en el diagnóstico del síndrome coronarlo agudo o el infarto de miocardio en un paciente sospechoso de tener una de estas afecciones.

19. Método de generación del anticuerpo o fragmento, según la reivindicación 2, en el que el método comprende

cultivar la línea de células CHO de la reivindicación 1.

2. Método de generación del anticuerpo o fragmento, según la reivindicación 3, en el que el método comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 8.