Anticuerpos contra NKG2D humano y usos de los mismos.

Anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo,

que compite con un anticuerpo de referencia en la unión a hNKG2D, donde el anticuerpo de referencia comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 44 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 45.

Anticuerpos contra NKG2D humano y usos de los mismos

Campo de la Invención 5

La presente invención se refiere a anticuerpos contra NKG2D humano (hNKG2D) y su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades y trastornos en pacientes humanos.

Antecedentes de la Invención 10

El inmunorreceptor NKG2D es normalmente expresado sobre células T CD8+ humanas y células NK. Sobre células CD8+ preactivadas, el receptor homodimérico de NKG2D humano (hNKG2D) funciona como un co-estimulante de señalización de TCR y CD28+TCR mediante su asociación a DAP10, mientras que en células NK funciona como un activador directo. Varios ligandos para hNKG2D han sido identificados y caracterizados, los cuales incluyen los ligandos 15 relacionados con la clase I de MHC, MICA y MICB, la familia de la proteína de unión a UL16 (ULBP) y la familia de transcrito-1 temprano de ácido retinoico (RAET1) .

En enfermedades autoinmunes crónicas tales como la artritis reumatoide, hNKG2D es expresado sobre un subconjunto de células T CD4+ CD28- y está implicado en la estimulación de su proliferación y producción de IFN y la 20 expresión de MIC es sobrerregulada (Groh et al., PNAS 2003; 100: 9452) . También se ha demostrado que las células T que expresan CD4+ hNKG2D en enfermedades de Crohn son mediadoras de respuestas inflamatorias y citotóxicas a través de interacciones de MICA (Allez et al., Gastroenterolog y 2007; 132: 2346-2358) . Una sugerencia inicial de que NKG2D es un impulsor esencial en inflamación autoinmune provino de la prevención y el tratamiento de la inflamación que conduce a diabetes en un modelo murino de diabetes (ratones NOD) por un anticuerpo monoclonal (mAb) que se 25 une a y bloquea NKG2D murino (CX5) (Ogasawara et al., Immunit y 2004; 20: 757-767) , lo que sugiere aplicaciones terapéuticas para anticuerpos anti-NKG2D. Esas aplicaciones han sido descritas, por ejemplo, en los documentos US20050158307, WO2005097160, WO2005115517 y WO2006024367.

La mayoría de los mAbs murinos contra NKG2D humano que se han descrito (véase, por ejemplo, Pende et al., 30 Eur J Immunol 2001;31: 1076-86, WO02068615; Bauer et al., Science 1999: 285: 727-9; Castriconi et al., PNAS 2003; 100: 4120-25; y André et al., Eur J Immunol 2004;34: 1-11) o están comercialmente disponibles (por ejemplo, anticuerpo 149810 de R&D Systems, MN, EUA y ON72 de Beckman Coulter Inc.) son inmunogénicos.

La US2006280755 se refiere a agentes de modulación de NKG2D para el tratamiento de enfermedades 35 autoinmunes, trastornos inflamatorios y rechazo de aloinjertos. Los agentes de modulación se caracterizan por el hecho de que reducen la interacción de NKG2D con DAP10, reducen la cantidad de NKG2D en la superficie celular, reducen la activación mediada por NKG2D y tienen un KD inferior a 1nM. Dichos agentes de modulación incluyen anticuerpos monoclonales humanos completos dirigidos contra NKG2D (y preparación de los mismos) . Sin embargo, no se han generado anticuerpos monoclonales humanos. 40

El único mAb anti-NKG2D completamente humano descrito en la literatura se reportó que tenía efectos agonísticos y antagonísticos sobre la señalización de NKG2D (Kwong et al., J Mol Biol 2008;384: 1143-1156) , lo que lo hace menos adecuado como agente terapéutico para trastornos inflamatorios y/o autoinmunes.

Por consiguiente, existe la necesidad de mAbs anti-hNKG2D con propiedades óptimas para su uso terapéutico en enfermedades y trastornos inflamatorios y/o autoinmunes. La presente invención se dirige a estas y otras necesidades y aporta varios beneficios que se describirán en el resto de este documento.

La WO2007/005874 divulga anticuerpos monoclonales humanos para ligando 1 de muerte programada (PD-L1) 50 donde el anticuerpo denominado 5F8 comprende la región VL idéntica (es decir, SEC. ID. Nº : 14) a la del anticuerpo MS de esta invención.

Resumen de la Invención [0009] La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-hNKG2D aislados útiles para aplicaciones terapéuticas en humanos. Típicamente, los anticuerpos son completamente humanos o humanizados para reducir al mínimo el riesgo de respuestas inmunes contra los anticuerpos cuando se administran a un paciente. Como se describe aquí, otras moléculas de unión al antígeno tales como por ejemplo, fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno, derivados de anticuerpo y moléculas multiespecíficas, pueden ser diseñados o derivados de esos anticuerpos. 60

En un aspecto, los anticuerpos se caracterizan por una o más propiedades funcionales o por una combinación de propiedades funcionales. Las propiedades ilustrativas incluyen, por ejemplo, prevenir la activación mediada por hNKG2D de células NK o T que expresan hNKG2D; competir con al menos un ligando hNKG2D natural o con varios ligandos, en la unión a hNKG2D; reducir la cantidad de hNKG2D sobre la superficie de una célula NK o T que expresa 65

hNKG2D; unir también NKG2D de Cynomolgus y/o Rhesus; unir sólo una molécula de anticuerpo por dímero de hNKG2D; entrelazar no más de 2 dímeros de hNKG2D cuando se añaden a células NK y/o T que expresan hNKG2D; tener efecto agonista insignificante sobre la señalización de hNKG2D durante la unión; y/o unir a hNKG2D con una constante de disociación (KD) de 1 nM o menor. Ciertos anticuerpos anti-hNKG2D de la invención también pueden o alternativamente competir con, unirse a esencialmente el mismo epítopo que, o unirse con la misma o superior afinidad 5 que, uno o más anticuerpos anti-hNKG2D humanos particulares descritos aquí, que incluyen anticuerpos MS y 21F2. Por ejemplo, en una forma de realización, los anticuerpos son también o alternativamente más capaces de competir con el bloqueo de unión a hNKG2D de MS y/o 21F2 que los anticuerpos anti-hNKG2D murinos conocidos (por ejemplo, aquellos descritos anteriormente) . En una forma de realización, los anticuerpos se unen al mismo epítopo de hNKG2D que MS y/o 21F2. En otra forma de realización, los anticuerpos también o alternativamente se unen al mismo epítopo 10 que MS. En otra forma de realización, los anticuerpos también o alternativamente se unen al mismo epítopo que 21F2. El experto en la técnica entenderá que los anticuerpos provistos por y/o usados en las formas de realización de esta invención pueden presentar tres, cuatro o más de las características anteriormente referenciadas.

En otro aspecto, los anticuerpos también o alternativamente comprenden uno o más paratopos y/o secuencias de 15 unión al antígeno que son idénticas o similares a los paratopos MS o 21F2 y/o secuencias de unión al antígeno descritas aquí.

En otros aspectos, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención, vectores de expresión que comprenden tales ácidos nucleicos, células huésped que comprenden esos ácidos nucleicos, células 20 huésped que producen anticuerpos de la invención y métodos para producir anticuerpos anti-hNKG2D mediante el cultivo de tales células huésped bajo condiciones apropiadas.

También se proporcionan fragmentos de unión al antígeno de tales anticuerpos, así como moléculas que comprenden los fragmentos de unión al antígeno, que incluyen fragmentos de anticuerpo genéticamente manipulados, 25 derivados de anticuerpo, anticuerpos biespecíficos y otras moléculas multiespecíficas.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas y kits u otros artículos que comprenden esos anticuerpos u otras moléculas.

Además se proporcionan métodos de reducción o inhibición de activación de hNKG2D, señalización de hNKG2D o activación de células NK o T que expresan hNKG2D mediante una o más propiedades funcionales o mediante una combinación de propiedades funcionales de los anticuerpos de la presente invención.

Además se proporcionan métodos para reducir la inflamación y métodos para tratar o prevenir enfermedades o 35 trastornos autoinmunes y/o inflamatorios, que incluyen pero no se limitan a artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD) que incluye la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa, lupus eritematoso sistémico (SLE) , psoriasis, artritis psoriática, esclerosis múltiple, enfermedad celíaca, enfermedad viral (tal como por ejemplo, hepatitis viral) y rechazo de trasplante de varios órganos y tejidos (que incluye pero no se limita a corazón y médula ósea) , mediante el uso de esos anticuerpos, moléculas y composiciones de la presente invención. 40

Breve Descripción de las Figuras

La figura 1 muestra los análisis de suero de ejemplo de ratones inmunizados con hNKG2D de la cepa KM mouse. El análisis de citometría de flujo sobre células BAF/3 que expresan NKG2D... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal humano aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que compite con un anticuerpo de referencia en la unión a hNKG2D, donde el anticuerpo de referencia comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 44 y una región variable de cadena ligera que comprende la 5 secuencia de SEC ID Nº : 45.

2. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, que se une a un epítopo que comprende Lys 150, Ser 151, Tyr 152, Thr 180, Ile 181, Ile 182, Glu 183, Met 184, Gln 185, Leu 191, Lys 197, Tyr 199, Glu 201, Thr 205, Pro 206, Asn 207 o Thr 208 de SEC ID Nº : 2 o cualquier combinación de los mismos. 10

3. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende un paratopo que incluye un residuo correspondiente a Gln 1, Asp 26, Asp 27, Ser 30, Ser 31, Tyr 32, Tyr 33, His 50, Ser 52, Tyr 53, Ser 54, Ser 56, Ala 57, Asn 58, Trp 98 o Asp 99 de SEC ID Nº : 44 o Tyr 33 o Trp 97 de SEC ID Nº : 45, o cualquier combinación de los mismos. 15

4. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 48;

(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 49; y 20

(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 50.

5. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 51; 25

(b) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 52; y

(c) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 53.

6. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

(a) una CDR1 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 48;

(b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 49; y

(c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 50; y

(d) una CDR1 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 51;

(e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 52; y 35

(f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 53.

7. Anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 44 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEC ID Nº : 45. 40

8. Anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se une a hNKG2D y entrecruza no más de dos dimeros de hNKG2D cuando se añade a células T o NK que expresan NKG2D.

9. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que, cuando se une a 45 un primer monómero de hNKG2D en un dímero de hNKG2D, bloquea la unión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno al segundo monómero de hNKG2D.

10. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el que la proporción de las áreas de exclusión de solvente del primer y segundo monómero de hNKG2D en un dímero de 50 hNKG2D es de aproximadamente 2:1 o más.

11. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es humano o humanizado.

12. Método para producir un anticuerpo anti-NKG2D, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende el cultivo de una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, bajo condiciones adecuadas y la recuperación de dicho anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.

13. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o anticuerpo producido en la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio o autoinmune.

14. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o anticuerpo producido en la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio o autoinmune, donde el trastorno 65 inflamatorio o autoinmune es artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico (SLE) , psoriasis,

enfermedad celíaca, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, rechazo de trasplante o enfermedad de injerto-versus-huésped

15. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o anticuerpo producido en la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio o autoinmune, donde el trastorno 5 inflamatorio o autoinmune es la enfermedad de Crohn.

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 4A

Fig. 4B

Fig. 6

Fig. 8

Fig. 9

Fig. 12

Fig. 15

Fig. 19

Fig. 21A

Fig. 21B

Fig. 21C