Anticuerpos contra C5 que inhibe la activación de las células endoteliales de tipo II.

Un anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos, que inhibe la expresión de selectina E y se une al mismo epítopo en C5 que el anticuerpo monoclonal 136-76,

obtenible del hibridoma que tiene el número de acceso al depósito ATCC PTA-2581.

Anticuerpos contra C5 que inhibe la activación de las células endoteliales de tipo II Antecedentes de la invención

El aumento de la escasez de órganos de donantes ha provocado un interés mundial en los xenotransplantes, es decir, el reemplazo de órganos humanos o tejidos con los de un donante de una especie diferente, tal como cerdos. Los recientes progresos ofrecen motivos para el optimismo, pero hay obstáculos que se deben superar.

Los xenotransplantes han sido clasificados en dos grupos, concordantes y discordantes, según la distancia filogenética entre las especies. Los animales que están evolutivamente cerca y no tienen anticuerpos naturales específicos entre sí son llamados concordantes. Los animales que son filogenéticamente distantes y rechazan órganos de una manera hiperaguda son llamados discordantes. Hay muchas gradaciones en medio y excepciones a la regla.

Los primates no humanos serían la fuente lógica de órganos para los seres humanos porque son los más estrechamente relacionados. Sin embargo, debido a consideraciones del tamaño de los órganos, carencia de disponibilidad y la probabilidad de transmisión de enfermedades infecciosas, la mayor parte de los investigadores han determinado que los primates no son la fuente preferida de órganos. En cambio, los cerdos son la opción más probable como fuente de órganos, debido a su fácil disponibilidad, semejanzas en el tamaño de los órganos, sus características de cría y la semejanza de los sistemas orgánicos respecto a los seres humanos. Sin embargo, los cerdos son una especie discordante respecto a los seres humanos.

Los xenoinjertos son objeto de cuatro mecanismos de rechazo: (1) rechazo hiperagudo mediado por anticuerpos preformados, (2) rechazo precoz o acelerado mediado por anticuerpos inducidos, (3) rechazo de xenoinjerto retrasado o rechazo vascular agudo (DXR/AVR) mediado por células T, y (4) rechazo crónico mediado por mecanismos de células T y células B. La inducción de los cuatro mecanismos puede ser atribuida a un mayor número de antígenos foráneos presentes que en el tejido del aloinjerto (uno de la misma especie, es decir, ser humano). Además, los receptores inhibitorios humanos a menudo no interactúan con otras moléculas MHC de clase I de la especie, permitiendo así la activación de varios mecanismos de rechazo que proceden sin inhibición.

Se ha descrito el trasplante de islotes pancreáticos porcinos y de un hígado de cerdo en pacientes humanos, (Makowka, et al., 1993; Satake, et al., 1993; Tibell, et al., 1993), pero los resultados no fueron positivos. Una mejor inhibición del rechazo de trasplantes con terapia farmacológica puede conducir a mejores resultados.

El rechazo hiperagudo (HAR) de xenoinjertos se inicia por la unión de anticuerpos xeno-reactivos a las células endoteliales del donante seguido de la activación del complemento, predominantemente mediante la ruta clásica. Los cerdos, por ejemplo, expresan un determinante de hidrato de carbono endotelial, gal a(1,3) gal, que no se expresa en seres humanos, y que es considerado un nuevo antígeno del grupo sanguíneo respecto al sistema inmunológico humano. La activación del complemento induce una activación del tipo I de las células endoteliales, un proceso que es rápido e independiente de la síntesis de proteínas. Se caracteriza por la retracción celular reversible, la translocación de selectina P a la superficie apical y la elaboración de diversas sustancias vasoactivas.

Además, se liberan proteoglicanos de sulfato de heparina desde la superficie de las células endoteliales dejando que la célula quede susceptible a daños procoagulantes y mediados por complemento. Las funciones críticas de las células endoteliales se pierden y el resultado final es una hemorragia intersticial, una trombosis difusa y daños del órgano irreversibles que aparecen en los pocos minutos o varias horas después del trasplante. Éstos son los rasgos característicos del HAR. El HAR puede prevenirse reduciendo la actividad del complemento o el nivel de los anticuerpos anti-xenoinjerto que aparecen de forma natural.

Incluso si se reduce o elimina el HAR, el xenoinjerto será rechazado después de unos días por el proceso denominado rechazo de xenoinjerto retrasado o rechazo vascular agudo (DXR/AVR). El DXR/AVR se caracteriza por una activación de las células endoteliales del tipo II, que depende de la síntesis de proteínas. Aunque se piense que DXR/AVR es, en gran parte, independiente del complemento, algunos estudios Indican que el complemento todavía puede estar implicado en DXR/AVR. La inhibición del complemento por el receptor del complemento soluble tipo I (sCR1) combinado con la inmunodepresión retrasó la aparición de DXR/AVR de corazones porcinos trasplantados en monos cynomolgus (Davis, EA et al., Trasplantation 62: 1018-23 (1996)). El trasplante de riñones de cerdo que expresan el factor acelerador de la degradación humano respecto a monos cynomolgus también tuvo algún efecto protector contra DXR/AVR (Zaidi A et al. Trasplantation 65: 1584-90 (1998); Loss M et al., Xenotransplantation 7: 186-9 (2000)). La adición de anticuerpos anti-células endoteliales y complemento en dosis sublítica indujo la expresión del factor de tejido (Saadi S et al., J. Exp. Med. 182: 1807-14 (1995)). Las células endoteliales porcinas expuestas a suero humano expresaron el inhibidor del activador de plasminógeno (Kalady MF et al., Mol. Med. 4: 629-37 (1998)) y aumentaron la expresión de varios genes de quimioquina (Selvan RS et al., J. Immunol. 161: 4388- 95 (1998)). Se encontró que el aumento de la expresión de varios genes de quimioquina dependía del complemento. Sin embargo, se demostró que un anticuerpo monoclonal anti-C5 era eficaz en la prevención del HAR, pero no del DXR/AVR (Wang, H. et al., Trasplantation 68: 1643-51 (1999)).

La selectina E (también conocida como ELAM-1, CD62 y CD62E) es una molécula de adhesión celular glicoproteíca de la superficie celular inducible por citoquinas que se encuentra exclusivamente en las células endoteliales. La selectina E media la adhesión de varios leucocitos, Incluyendo neutrófilos, monocitos, eosinófilos, linfocitos T cltotóxlcos, y un subconjunto de células T, frente al endotelio activado (Bevllacqua, et al., Science 243: 1160 (1989); Shlmuzu, et al., Nature 349: 799 (1991); Graber, et al., J. Immunol. 145: 819 (1990); Carlos, et al., Blood 77: 2266 (1991); Hakkert, et al., Blood 78: 2721 (1991); y Picker, et al., Nature 349: 796 (1991)). La expresión de selectina E se induce en el endotelio humano en respuesta a las citoquinas IL-1 y TNF, asi como lipopolisacárldos bacterianos (LPS), por la sobre-regulación transcripcional (Montgomery, et al., Proc Nati Acad Sel 88: 6523 (1991)).

Se ha identificado el receptor de leucocitos humano para la selectina E humana (Berg, et al., J. Blol. Chem. 23: 14869 (1991) y Tyrrell, et al., Proc Nati Acad Sci 88: 10372 (1991)). Estructuralmente, la selectina E pertenece a una familia de moléculas de adhesión llamadas "selectinas" que también incluyen a la selectina P y la selectina L (véanse las revisiones en Lasky, Science 258: 964 (1992) y Bevilacqua y Nelson, J. Clin. Invest. 91: 379 (1993)). Estas moléculas se caracterizan por propiedades estructurales comunes tales como un dominio tipo lectlna del extremo amino-terminal, un dominio del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un pequeño número de módulos de repetición del complemento (aproximadamente 60 aminoácidos cada uno) similares a los encontrados en ciertas proteínas de unión del complemento.

Clínicamente, el aumento de la expresión de la selectina E en el endotelio tiene que ver con una variedad de reacciones inflamatorias agudas y crónicas mediadas por los leucocitos, incluyendo el rechazo de alolnjertos (Alien, et al., Clrculatlon 88: 243 (1993); Brockmeyer, et al., Trasplantation 55: 610 (1993); Ferran, et al., Trasplantaron 55: 605 (1993); y Taylor, et al., Trasplantation 54: 451 (1992)). Los estudios en los cuales se ha Investigado la expresión de la selectina E humana en aloinjertos cardíacos y renales que sufren un rechazo celular agudo han demostrado que la expresión de selectina E está sobreregulada selectivamente en el endotelio vascular del tejido renal y cardíaco durante el rechazo agudo. Además, el aumento de la expresión de la selectina E guarda correlación con el curso precoz del rechazo celular y corresponde a la migración de células Inflamatorias en el tejido del Injerto. Tomados juntos, estos estudios proporcionan pruebas de que la expresión inducida por citoquina de la selectina E por el endotelio del órgano del donante contribuye a la unión y la subsecuente transmigración de células inflamatorias en el tejido del injerto y así desempeña un papel importante... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal o uno de sus fragmentos, que inhibe la expresión de selectina E y se une al mismo epítopo en C5 que el anticuerpo monoclonal 136-76, obtenible del hibridoma que tiene el número de acceso al depósito ATCC PTA-2581.

2. El anticuerpo monoclonal 137-76, obtenible del hibridoma que tiene el número de acceso del depósito de ATCC PTA-2581, o uno de sus fragmentos.

3. El anticuerpo monoclonal o fragmento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

4. El anticuerpo monoclonal o fragmento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo desinmunizado.

5. El anticuerpo monoclonal o fragmento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

6. El anticuerpo monoclonal o fragmento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano.

7. El fragmento de la reivindicación 1 o reivindicación o la reivindicación 2, en el que el fragmento es Fab, F(ab)2, Fv, o un anticuerpo de una sola cadena.

8. El fragmento de la reivindicación 7, que es un Fv de una sola cadena.

9. El anticuerpo monoclonal o fragmento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que está conjugado con

un polialcohol polioxietilado o un polietilenglicol.

10. Una linea celular que produce el anticuerpo monoclonal o fragmento de la reivindicación 1.

11. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 2.

12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en el método de diagnóstico de la

presencia de C5 en una muestra de tejido o una muestra de fluido corporal.

13. El anticuerpo para uso como se define en la reivindicación 12, en el que dicha muestra de fluido corporal es suero, plasma, orina o fluido espinal.

14. El anticuerpo para uso como se define en la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que dicha presencia de C5 está por debajo del nivel normal.

15. El anticuerpo para uso como se define en la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que dicha presencia de C5 está por encima del nivel normal.