Anticuerpo PcrV humanizado con actividad anti-pseudomonas.

Un anticuerpo monoclonal humanizado contra PcrV o una parte de dicho anticuerpo,

que tiene

1) en una región variable de la cadena pesada, regiones determinantes de la complementariedad que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15) para CDR-H1, INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) para CDR-H2 e YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) para CDR-H3 y

2) en una región variable de la cadena ligera, regiones determinantes de la complementariedad que

incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18) para CDR-L1, TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) para CDR-L2 y HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 20) para CDR-L3;

y que tiene al menos una característica seleccionada de (A) a (C):

(A) inhibe 50% o más de citotoxicidad a células de leucocitos de Pseudomonas aeruginosa a una concentración de 1 nM a 200 nM in vitro;

(B) inhibe 50% o más de citotoxicidad a células de mieloma de Pseudomonas aeruginosa a una concentración de 1 nM a 50 nM in vitro; y

(C) tiene una constante de disociación (Kd) con PcrV de 2 x 10-9 (M) o menor.

Anticuerpo PcrV humanizado con actividad anti-pseudomonas Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humanizado que reconoce PcrV, o una parte del 5 mismo. Más específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene una mayor actividad neutralizante (en adelante, también referida como actividad inhibidora de citotoxicidad) que los anticuerpos anti-PcrV convencionales, o una parte del mismo, y a una composición farmacéutica que contiene el mismo.

Técnica de Antecedentes

Pseudomonas aeruginosa es obligadamente un bacilo gram-negativo aerobio que existe ampliamente en el mundo 1 natural. A pesar de que su patogenicidad es habitualmente baja, es un patógeno que causa infecciones oportunistas que con frecuencia se producen en pacientes que padecen diversas enfermedades pre-existentes, tales como cáncer y diabetes, y en pacientes a quienes se han administrado productos farmacéuticos que tienen una acción inhibidora inmune y, a menudo, puede causar neumonía, infección del tracto urinario, septicemia o similar, que conducen a resultados graves. En los sectores clínicos, la infección por Pseudomonas aeruginosa se considera 15 como una de las infecciones más difíciles de ser tratada, ya que Pseudomonas aeruginosa no sólo tiene inherentemente una baja sensibilidad a los antibióticos existentes, sino que también tiene una alta tendencia a adquirir fácilmente resistencia a diversos antibióticos y llegar a ser difícil de curar. Así, para Pseudomonas aeruginosa, la medida de desarrollar nuevos antibióticos uno tras otro es limitada, y es muy deseable un método terapéutico que no se base en antibióticos.

Una alta citotoxicidad de Pseudomonas aeruginosa se ejerce mediante la inyección de toxina en una célula eucariota a través de un sistema de secreción de exotoxina de tipo III. PcrV es una proteína de 294 residuos (NCBI N° de Acceso AAC45935, SEQ ID NO: 1) que constituye el sistema de secreción de exotoxina de tipo III, y una secuencia de operón que codifica la misma está abierto al público (documento de patente 1, documento no de patente 1). Dado que el control de PcrV posiblemente puede conducir a un medio terapéutico en la infección de 25 Pseudomonas aeruginosa (documento no de patente 2), se reseñan anticuerpos policlonales (documentos no de patente 3, 4) y anticuerpos monoclonales (documento de patente 2, documentos no de patente 5, 6) contra PcrV que tienen actividad neutralizante. Sin embargo, los anticuerpos policlonales son difíciles de humanizar y de ser utilizados como composiciones farmacéuticas, debido a la dificultad en la mejora de la antigenicidad. También los anticuerpos monoclonales que han sido reseñados hasta ahora tienen una baja actividad neutralizante y no logran 3 satisfacer los requisitos en sectores clínicos.

Documento de patente 1: Patente de EE.UU. N° 6.551.795

Documento de patente 2: Traducdón japonesa de la publicación PCT N° 25-525 Documento no de patente 1: Yahr, T.L. et al., J. Bacteriol., 1997, vol. 179, pág. 7165 Documento no de patente 2: T. Sawa et al, Nature Medicine, 1999, vol. 5, pág. 392 35 Documento no de patente 3: Shime N et al, J. Immunol.. 21, vol. 167, pág. 588 Documento no de patente 4: ImamuraY et al, Eur. Respir. J., 27, vol. 29, pág. 965 Documento no de patente 5: Karine Faure et al, J. inmune. Based. Therapies and Vaccines, 23, vol. 1 Documento no de patente 6: Dara W. Frank et al, J. Infect. Disease, 22, vol. 186, pág. 64 Sumario de la invención 4 Problema a ser resuelto por la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar una medida que sea eficaz en la terapia de infecciones, en particular la infección por Pseudomonas aeruginosa.

Medios para resolver el problema

Como resultado de diligentes esfuerzos de preparación de anticuerpos monoclonales contra PcrV, los autores de la presente invención han tenido éxito en la preparación de un nuevo anticuerpo monoclonal humanizado que se considera que tiene un mayor efecto terapéutico sobre la enfermedad en comparación con un anticuerpo monoclonal contra-PcrV conocido convencionalmente, y han completado la presente invención.

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado contra PcrV o una parte de dicho anticuerpo, según se define en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona también:

- una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o parte del mismo;

- el anticuerpo o parte del mismo, para uso en métodos de tratamiento médico;

- el uso del anticuerpo o parte del mismo en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas inducidas por Pseudomonas aeruginosa;

- un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada y/o una región variable de la

cadena ligera del anticuerpo; y

- un vector de expresión que comprende el polinucleótido, todo ello según se define en las reivindicaciones.

Efecto de la Invención

Un anticuerpo monoclonal humanizado o una de parte del mismo de la presente invención es útil como un agente de prevención y/o un agente de tratamiento de enfermedades infecciosas inducidas por Pseudomonas aeruginosa, debido a su muy excelente actividad neutralizante en PcrV

Breve explicación de los dibujos

[Fig. 1] Fig. La Fig. 1 muestra curvas en las que PcrV marcada con biotina está sustituida con PcrV no marcada en anticuerpos de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166).

[Fig. 2] La Fig.2 muestra afinidades de los anticuerpos de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166) determinadas por análisis de resonancia de plasmón superficial.

[Fig. 3] La Fig. 3 muestra los resultados de ensayos de sándwich entre anticuerpos de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166) y Mab166.

[Fig. 4] La Fig. 4 muestra efectos inhibidores de anticuerpos de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166) sobre la citotoxicidad de células U937 de la cepa SR24 de Pseudomonas aeruginosa.

[Fig. 5] La Fig. 5 muestra efectos inhibidores de anticuerpos de PcrV (1F3, 2A4, 6F5, 7A7 y Mab166) sobre la citotoxicidad de células de mieloma P3U1 de la cepa SR24 de Pseudomonas aeruginosa.

[Fig. 6] La Fig. 6 muestra curvas en las que PcrV marcada con biotina está sustituida con PcrV de longitud completa no marcada y PcrV truncada en anticuerpos de PcrV (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 y Mab166).

[Fig. 7] La Fig. 7 muestra reactividad con PcrV de longitud completa y PcrV truncada en anticuerpos de PcrV (1F3, 2A4, 9D12, 12H9 y Mab166) en transferencia Western.

[Fig. 8] La Fig. 8 muestra la correlación entre el anticuerpo y la PcrV de longitud completa por la supresión de la actividad inhibidora de la citotoxicidad.

[Fig. 9] La Fig. 9 muestra la correlación entre el anticuerpo y la PcrV truncada por la supresión de la actividad inhibidora de la citotoxicidad.

[Fig. 1] La Fig. 1 muestra la secuencia de aminoácidos de una región variable del anticuerpo 1F3. Lo subrayado indica una región CDR.

[Fig.11] La Fig. 11 muestra la secuencia de aminoácidos de una región variable del anticuerpo 2A4. Lo subrayado indica una región CDR.

[Fig. 12] La Fig. 12 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo de ratón (Ratón 1F3), el anticuerpo humanizado molde (Molde), el anticuerpo humanizado mutante (Retromutación) y el anticuerpo humanizado (Flumanizado 1F3).

[Fig. 13] La Fig. 13 muestra la afinidad entre el antígeno de PcrV y cada una de las combinaciones de la cadena pesada de un anticuerpo quimérico (quimera H) de ratón-ser humano, la cadena ligera del mismo (quimera L), la cadena pesada del anticuerpo humanizado molde (HT), la cadena ligera del mismo (LT), la cadena pesada del anticuerpo humanizado mutante (HB) y la cadena ligera del mismo (LB).

[Fig. 14] La Fig. 14 muestra la afinidad de los anticuerpos que incluyen cada una de las combinaciones de la cadena pesada del anticuerpo quimérico de ratón-ser humano (quimera H), la cadena ligera de anticuerpo quimérico de ratón-ser humano (quimera L), los mutantes de la cadena pesada del anticuerpo humanizado mutante (I48M, A67V, L69M, V71R, A78V, V93A y L94R), y la cadena ligera del anticuerpo humanizado molde (LT), con el antígeno de PcrV.

[Fig. 15] La Fig. 15 muestra la secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado. Lo subrayado indica una región CDR.

[Fig. 16] La Fig. 16 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de una cadena ligera del anticuerpo humanizado. Lo subrayado indica una región CDR.

[Fig. 17] La Fig. 17 muestra la afinidad entre el antígeno de PcrV y cada una... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal humanizado contra PcrV o una parte de dicho anticuerpo, que tiene

1) en una región variable de la cadena pesada, regiones determinantes de la complementariedad que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: SFTSYWMH (SEQ ID NO: 15) para CDR-H1,

INPSNGRTNYNEKFNT (SEQ ID NO: 16) para CDR-H2 e YGNYVVYYTMDY (SEQ ID NO: 17) para CDR-H3 y

2) en una región variable de la cadena ligera, regiones determinantes de la complementariedad que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos: SASTSVSYME (SEQ ID NO: 18) para CDR-L1, TTSKLAS (SEQ ID NO: 19) para CDR-L2 y HQWRNYPFT (SEQ ID NO: 2) para CDR-L3;

y que tiene al menos una característica seleccionada de (A) a (C):

(A) inhibe 5% o más de citotoxicidad a células de leucocitos de Pseudomonas aeruginosa a una

concentración de 1 nM a 2 nM in vitro;

(B) inhibe 5% o más de citotoxicidad a células de mieloma de Pseudomonas aeruginosa a una concentración de 1 nM a 5 nM in vitro; y

(C) tiene una constante de disociación (Kd) con PcrV de 2 x 1"9 (M) o menor.

2. Un anticuerpo monoclonal humanizado o una parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene

3) una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27, y

4) una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.

3. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o una parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en calidad de un ingrediente activo.

4. El anticuerpo o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para uso en un método de

tratamiento médico.

5. El anticuerpo o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para uso en un método de prevención o tratamiento de una enfermedad infecciosa inducida por Pseudomonas aeruginosa.

6. Uso del anticuerpo o parte del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la fabricación de 25 un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad infecciosa inducida por Pseudomonas

aeruginosa.

7. Un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

8. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 7.