Amplificación específica de alelo usando un cebador con un nucleótido modificado.

Un método de amplificación específica de alelo de una variante de una secuencia diana,

que existe en forma de varias secuencias variantes, que comprende

(a) proporcionar una muestra, que contiene posiblemente al menos una variante de una secuencia diana;

(b) proporcionar un primer oligonucleótido, al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana;

(c) proporcionar un segundo oligonucleótido, al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana, que tiene un nucleótido 3' terminal complementario de solamente una variante de la secuencia diana; en el que dicho segundo oligonucleótido incorpora al menos un nucleótido con una base modificada covalentemente en el grupo amino exocíclico, en el que dicha base se selecciona de un grupo que consiste en N6-bencil-adenina, N6-para-terc-butil-bencil adenina, N2-alquil-guanina y N4-bencil-citosina;

(d) proporcionar condiciones adecuadas para la hibridación de dichos primero y segundo oligonucleótidos con al menos una variante de la secuencia diana; y

(e) proporcionar condiciones adecuadas para la extensión de oligonucleótido por un biocatalizador que incorpora nucleótidos;

en el que dicho biocatalizador es capaz de extender dicho segundo oligonucleótido cuando se hibrida con la variante de la secuencia diana para la que tiene dicho nucleótido 3' terminal complementario, y sustancialmente menos cuando dicho segundo oligonucleótido hibrida con la variante de la secuencia diana para la que tiene un nucleótido 3' terminal no complementario.

Amplificación específica de alelo usando un cebador con un nucleótido modificado La amplificación especifica de alelo de ácidos nucleicos permite la amplificación y el análisis simultáneos de la secuencia diana. La amplificación específica de alelo se usa habitualmente cuando se sospecha que el ácido nucleico diana tiene una o más subpoblaciones con una variación (polimorfismo) en su secuencia. Se usan polimorfismos de ADN en el análisis del perfil de ADN (criminalística, ensayos de paternidad, tipificación de tejidos para trasplantes de órganos) , mapeo genético, así como detección de mutaciones poco habituales, tales como las que aparecen en células cancerosas en el fondo de células con ADN normal.

En una amplificación específica de alelo exitosa, la variante deseada del ácido nucleico diana se amplifica, mientras que las otras variantes no, al menos no a un nivel detectable. Un ensayo de amplificación específico de alelo típico implica una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la que al menos un cebador es complementario de la región con un polimorfismo sospechado. El diseño del cebador específico de alelo es tal que se produce extensión del cebador solamente cuando está presente una cierta variante del polimorfismo. En su forma más sencilla, el cebador específico de alelo tiene un nucleótido 3’ terminal complementario de la variante deseada del nucleótido polimórfico en la diana. Con frecuencia, una única falta de coincidencia en el extremo 3’ terminal del cebador es suficiente para evitar la amplificación de las variantes no deseadas de la secuencia diana. Sin embargo, la especificidad de la amplificación varía en gran medida entre diferentes secuencias 3’ terminales: algunas faltas de coincidencia bloquean eficazmente la extensión por la polimerasa, mientras que otras no, véase Patente de Estados Unidos Nº 5.639.611.

El éxito de la diferenciación alélica depende de la incapacidad de la ADN polimerasa para extender cebadores no coincidentes. Esta incapacidad de la ADN polimerasa puede modularse ajustándose a las condiciones de reacción para conseguir la selectividad máxima. No obstante, la escasa selectividad de la PCR específica de alelo sigue siendo un problema para muchas secuencias polimórficas.

Un enfoque para aumentar la especificidad implica modificar por ingeniería genética cebadores de amplificación con un nucleótido o nucleótidos no coincidentes internos. Este enfoque ha demostrado ser exitoso en algunos sistemas, véase Patente de Estados Unidos 5.137.806.

Otro enfoque para aumentar la especificidad implica la modificación química de los cebadores. Por ejemplo, se descubrió que ciertas modificaciones 2’-C y 4’-C de la desoxirribosa de algunos nucleótidos en el cebador potencian la diferenciación de alelos por la polimerasa, véase Gaster, J. y Marx, A., Chem. Eur. J. 2005, 11: 1861-1870. En otro estudio, se ha descubierto que la diferenciación alélica está potenciada por el uso de una base pirimidímica no natural en uno de los nucleótidos en el cebador, específicamente, pseudoisocitidina con diversos sustituyentes en la posición 6 del anillo de pirimidina, véase Patente de Estados Unidos Nº 7.408.051. Otro enfoque, la Solicitud de PCT WO00/43544, describe el uso de cebadores modificados por la inclusión de nucleótidos de etenoadenina que tienen una modificación en el grupo amino exocíclico en PCR específica de alelos. Se muestra además que la especificidad es mucho mayor si el cebador tanto inverso como directo contiene nucleótidos modificados.

Se desvelan además cebadores modificados en la Solicitud de Patente Europea 0 974 672 y la Patente de Estados Unidos 6.001.611; ninguno de los documentos dicen nada, sin embargo, acerca de una reacción de amplificación específica de alelo. La Solicitud de Patente Europea 0 974 672 se dirige a un método para llevar a cabo Polimorfismo de Longitud de Fragmento Amplificado (AFLP) ; los cebadores usados en el proceso para amplificar específicamente dianas adaptadoras contienen nucleótidos que pueden modificarse en el grupo amino exocíclico. La Patente de Estados Unidos 6.001.611 desvela cebadores que contienen un nucleótido modificado (por ejemplo, grupo bencilo o alquilo) en la posición -1 a -5 en relación con el nucleótido 3’ para usar para reacciones de PCR generales.

En el contexto de la PCR específica de alelo en tiempo real, la selectividad del ensayo puede medirse como la diferencia en el número de ciclos umbral (Ct) entre los moldes coincidentes y no coincidentes. Una mayor diferencia indica un mayor retardo en la amplificación del molde no coincidente y por lo tanto una mayor diferenciación entre alelos. Se ha mostrado que la desoxirribosa modificada da como resultado diferencias de Ct de entre 1 y 14 ciclos. El uso de pseudoisocitidina dio como resultado un retardo de 7 ciclos en la amplificación del molde no coincidente. Este grado de diferenciación es insuficiente para muchas aplicaciones, cuando la muestra contiene varias variantes del molde, compitiendo todas para su amplificación. Con frecuencia el molde no coincidente está presente en cantidades mucho mayores que el molde coincidente. Por ejemplo, en muestras tisulares, solamente una fracción pequeña de células puede ser maligna y portar la mutación (“molde coincidente”) , a la que se dirige el ensayo de amplificación específico de alelo. El molde presente en células normales puede amplificarse menos eficazmente, pero los abrumadores números de células normales superarán cualquier retardo en la amplificación y eliminarán cualquier ventaja del molde mutante. Para detectar mutaciones poco habituales en presencia de molde de tipo silvestre, es necesario mejorar la especificidad del ensayo de amplificación específico de alelo.

Sumario de la invención En general, la invención se refiere a un método mejorado de amplificación específica de alelo, en el que uno o más nucleótidos en el cebador o los cebadores específicos de alelo se modifican por un enlace covalente de un grupo 5 modificador definido con un grupo amino exocíclico de la base nucleotídica. La modificación puede producirse de forma interna o en el extremo 3’ del cebador, o ambos.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para amplificación específica de alelo de una variante de una secuencia diana, que existe en forma de varias secuencias variantes, que comprende

(a) proporcionar una muestra, que contiene posiblemente al menos una variante de una secuencia diana;

(b) proporcionar un primer oligonucleótido, al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana;

(c) proporcionar un segundo oligonucleótido, al menos parcialmente complementario de una o más variantes de

la secuencia diana, que tiene al menos un nucleótido 3’ terminal complementario solamente de una variante de la secuencia diana; en el que dicho segundo oligonucleótido incorpora al menos un nucleótido con una base modificada covalentemente en el grupo amino exocíclico, en el que dicha base se selecciona de un grupo que consiste en N6-bencil-adenina, N6-para-terc-butil-bencil adenina, N2-alquil-guanina y N4-bencil-citosina;

(d) proporcionar condiciones adecuadas para la hibridación de dichos primer y segundo oligonucleótidos con al menos una variante de la secuencia diana; y

(e) proporcionar condiciones adecuadas para la extensión del segundo oligonucleótido por un biocatalizador que incorpora nucleótidos; en el que dicho biocatalizador es capaz de extender dicho segundo oligonucleótido cuando hibrida con la variante de la secuencia diana para la que tiene dicho nucleótido 3’ terminal complementario, y sustancialmente menos cuando dicho segundo oligonucleótido se hibrida con la variante de la

secuencia diana para la que tiene un nucleótido 3’ terminal no complementario.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para detectar una variante de una secuencia diana en una muestra, que existe en forma de varias secuencias variantes que comprende (a) hibridar un primer y segundo oligonucleótidos con al menos una variante de la secuencia diana; en el que el primer oligonucleótido es al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana y el segundo oligonucleótido es al menos parcialmente complementario de una o varias variantes de la secuencia diana y tiene un nucleótido 3’ terminal complementario de solamente una variante de la secuencia diana, incorporando dicho segundo oligonucleótido al menos un nucleótido con una base modificada covalentemente en el grupo amino exocíclico, en el que dicha base se selecciona de un... [Seguir leyendo]

1. Un método de amplificación específica de alelo de una variante de una secuencia diana, que existe en forma de varias secuencias variantes, que comprende

(a) proporcionar una muestra, que contiene posiblemente al menos una variante de una secuencia diana;

(b) proporcionar un primer oligonucleótido, al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana;

(c) proporcionar un segundo oligonucleótido, al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana, que tiene un nucleótido 3’ terminal complementario de solamente una variante de la secuencia diana; en el que dicho segundo oligonucleótido incorpora al menos un nucleótido con una base modificada covalentemente en el grupo amino exocíclico, en el que dicha base se selecciona de un grupo que consiste en N6-bencil-adenina, N6-para-terc-butil-bencil adenina, N2-alquil-guanina y N4-bencil-citosina;

(d) proporcionar condiciones adecuadas para la hibridación de dichos primero y segundo oligonucleótidos con al menos una variante de la secuencia diana; y

(e) proporcionar condiciones adecuadas para la extensión de oligonucleótido por un biocatalizador que incorpora nucleótidos; en el que dicho biocatalizador es capaz de extender dicho segundo oligonucleótido cuando se hibrida con la variante de la secuencia diana para la que tiene dicho nucleótido 3’ terminal complementario, y sustancialmente menos cuando dicho segundo oligonucleótido hibrida con la variante de la secuencia diana para la que tiene un nucleótido 3’ terminal no complementario.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el nucleótido que tiene una base modificada covalentemente en el grupo amino exocíclico se localiza en las posiciones -5, -4, -3, -2 o -1 en relación con el extremo 3’ del segundo oligonucleótido.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho biocatalizador que incorpora nucleótidos en la etapa (e) es capaz de extender dicho segundo oligonucleótido, exclusivamente cuando dicho oligonucleótido hibrida con la variante de la secuencia diana con la que tiene dicho nucleótido 3’ terminal complementario.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicho biocatalizador que incorpora nucleótidos se selecciona de un grupo que consiste en ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa Z05, ADN polimerasa Z05 y ADN polimerasa Z05-Gold.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia diana es SEC ID Nº : 1 y/o SEC ID Nº : 2.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicho segundo oligonucleótido tiene un formato scorpion o tipo scorpion.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicho primer oligonucleótido es SEC ID Nº : 6 y/o dicho segundo oligonucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº : 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11; 12 y 13.

8. Un método para detectar una variante de una secuencia diana en una muestra, que existe en forma de varias secuencias variantes que comprende

(a) hibridar un primer y segundo oligonucleótidos con al menos una variante de la secuencia diana; en el que el primer oligonucleótido es al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana y el segundo oligonucleótido es al menos parcialmente complementario de una o varias variantes de la secuencia diana y tiene un nucleótido 3’ terminal complementario de solamente una variante de la secuencia diana, incorporando dicho segundo oligonucleótido al menos un nucleótido con una base modificada covalentemente en el grupo amino exocíclico, en el que dicha base se selecciona de un grupo que consiste en N6-bencil-adenina, N6-para-terc-butil-bencil adenina, N2-alquil-guanina y N4-bencil-citosina;

(b) extender el segundo oligonucleótido con un biocatalizador que incorpora nucleótidos; en el que dicho biocatalizador es capaz de extender de forma detectable solamente el oligonucleótido, hibridado con la variante de la secuencia diana para la que tiene dicho nucleótido 3’ terminal complementario; y

(c) detectar los productos de dicha extensión del segundo oligonucleótido, en el que la extensión indica la presencia de la variante de una secuencia diana con la que el oligonucleótido tiene un nucleótido 3’ terminal complementario.

9. Un kit para amplificación específica de alelo de una secuencia diana, que existe en forma de varias secuencias variantes, que comprende

(a) un primer oligonucleótido, al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana;

(b) un segundo oligonucleótido, al menos parcialmente complementario de una o más variantes de la secuencia diana y que tiene un nucleótido 3’ terminal complementario de solamente una variante de la secuencia diana; en

el que dicho segundo oligonucleótido incorpora al menos un nucleótido con una base modificada covalentemente en el grupo amino exocíclico, en el que dicha base se selecciona de un grupo que consiste en N6-bencil-adenina, N6-para-terc-butil-bencil adenina, N2-alquil-guanina y N4-bencil-citosina; y

(c) un biocatalizador que incorpora nucleótidos, nucleósido trifosfatos, tampón adecuado para la extensión de ácidos nucleicos por biocatalizadores que incorporan nucleótidos y un conjunto de instrucciones para realizar amplificación específica de alelo.

10. Un oligonucleótido para realizar una amplificación específica de alelo de una secuencia diana, que existe en forma de varias secuencias variantes, que comprende 10

-una secuencia al menos parcialmente complementaria de una parte de una o más variantes de dicha secuencia diana;

-un nucleótido 3’ terminal que es complementario de solamente una variante de dicha secuencia diana;

-al menos un nucleótido con una base modificada covalentemente en el grupo amino exocíclico, en el que

dicho nucleótido modificado se localiza en las posiciones -5, -4, -3, -2 o -1 en relación con el nucleótido 3’ terminal, en el que dicha base se selecciona de un grupo consiste en N6-bencil-adenina, N6-para-terc-butil-bencil adenina, N2-alquil-guanina y N4-bencil-citosina; y

-que tiene una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en SEC ID Nº : 4, 5, 8, 11 y 13.