Procedimiento de aislamiento de cimirracemato A.

Un procedimiento de aislamiento de cimirracemato A de una especie Cimifuga,

que comprende las etapas de:

a) proporcionar una cantidad suficiente de materia prima de una especie Cimicifuga;

b) mezclar la materia prima de una especie Cimifuga con un disolvente polar acuoso a una temperatura de 20°C a 28°C para obtener un extracto de disolvente que comprende cimirracemato A, en el que el disolvente polar acuoso es agua o agua-etanol que comprende etanol a una concentración de menos del 20%; y

c) aislar cimirracemato A del extracto de disolvente.

Procedimiento de aislamiento de cimirracemato A Antecedentes de la técnica

Se han usado varias especies de Cimicifuga como agentes terapéuticos para enfermedades inflamatorias en la medicina china, coreana y japonesa. Igualmente, las composiciones que contiene el cohosh negro, conocida en botánica como Cimicifuga racemosa L. Nutt (también Actaea racemosa), son ampliamente usadas como suplementos dietéticos a base de hierbas en Estados Unidos y Europa. Históricamente, las mujeres nativas americanas usaban cohosh negro para el tratamiento del malestar, malaria, reumatismo, función renal anormal, dolor de garganta, irregularidades menstruales y enfermedades asociadas con el parto (Blementhal y col., 2). En los países asiáticos, esta hierba y otras especies de Cimicifuga incluyendo Cimicifuga dahuríca (Turcz.) Maxim., Cimicifuga foelida L., y Cimicifuga heracleifolia Kom. se usan para tratar la inflamación, fiebre, dolor de cabeza, dolor, dolor de garganta y escalofríos (Foster, 1999; Kusano, 21; Kim y col., 24). Sin embargo, todavía se desconocen plenamente los mecanismos de acción subyacentes de estas hierbas.

Se han investigado previamente las actividades biológicas del cohosh negro. Se demostró que los extractos de cohosh negro in vivo, inhiben la reacción de anafilaxia cutánea pasiva inducida por anti-lgE en ratas Sprague Dawley de una manera dependiente de la dosis (Kim y col., 24). Los extractos de hierbas in vitro inhiben la transcripción de citoquinas incluyendo IL-4, IL-5 y TNF-a por medio de agentes inflamatorios tales como PMA y A2387 en mastocitos de leucemia humana HMC-1 (Kim y col., 24). Otros estudios también demostraron los efectos inhibitorios del extracto de cohosh negro en histamina, bradiquinina y COX-2 mediada por acciones inflamatorias (Kim y Kim, 2). Sin embargo, la componentes activos presentes en el extracto son desconocidos.

El cimirracemato A es el éster formado entre ácido isoferúlico y 3-(3, 4-dihiroxilfenil) -2-ketopropanol (Chen y col., 25). El cimirracemato A es un compuesto de origen natural que posee un esqueleto 1,7-diarilo. Otros compuestos con este esqueleto 1,7-diarilo tienen actividades biológicas significativas (Roughley y Whiting, 1973). Por ejemplo, se ha reseñado que la curcumina, un pigmento natural aislado de Cúrcuma tonga inhibe el crecimiento de varios tipos de células malignas (Chen y col., 1999; Aggarwal y col., 24) y, especialmente, en el caso del infección por VIH (Vlietinck y col., 1998). La yakuchinona B extraída de semillas de Alpina oxyphylla (Itokawa y col., 1982) es activa contra la hipercolesterolemia y la aterosclerosis (Ohishi y col., 21).

He y col., Journal of Chromotography A, 26, Vol. 1112, págs. 241 - 254, desvela una extracción de material vegetal de Cimicifuga que usa metanol al 75%.

Chen et., Phytochemistry, 22, vol. 61, págs. 49 - 413 desvela el aislamiento de varios cimirracematos por extracción con metanol.

Burdette y col., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 22, vol. 5, págs. 722 - 728 desvela la extracción de raíces de Cimicifuga racemosa por percolación con metanol. El extracto de metanol se fracciona posteriormente mediante particiones sucesivas con acetato de etilo y n-butanol.

Se ha descubierto que el cimirracemato A suprime TNF-a inducida por LPS en macrófagos humanos e inhibe las actividades de la MAP quinasa inducida por LPS, así como la activación de factores de transcripción específicos. Además, el cimirracemato A puede tener beneficios adicionales para la salud, incluyendo eliminadores de especies reactivas del oxígeno (Burdette y col., 22). Tomados en conjunto, los compuestos, como cimirracemato A, con esqueleto 1,7-diarilo, pueden tener múltiples bioactividades que pueden actuar a través de múltiples mecanismos dependientes de células.

La C. racemosa ha estado experimentando un aumento espectacular en el consumo en Estados Unidos y Europa. Sus productos se preparan en forma de extractos isopropanólicos y etanólicos actualmente disponibles para los consumidores en una variedad de formulaciones y dosificaciones. El uso de esta hierba ha sido a base de extractos, en lugar de los componentes bioactivos individuales. Aunque se han aislado algunos compuestos de C. racemosa, incluyendo glucósidos triterpénicos y fenólicos, sus bioactividades y presencia constante en los extractos todavía tienen que determinarse (Kennelly y col., 22).

Otro componente aislado C. racemosa es 23-ep¡-26- desoxiacteína. El componente 23-epi-26-desoxiacteína se usa actualmente en forma de marcador químico para normalizar productos de C. racemosa comerciales. La razón de su uso es su abundancia en el extracto (Pepping, 1999). Por lo tanto, el marcador químico usado para la normalización de los extractos de C. racemosa no es necesariamente representativo de la bioactividad de esta hierba.

Muchas especies diferentes de cimicifuga se usan tradicionalmente para curar la inflamación; sin embargo, como

se indica en la figura 1, sus componentes químicos son relativamente diferentes en las mismas condiciones de análisis. Aunque se han desarrollado procedimientos diferentes para distinguir las especies de Cimidfuga usando el enfoque de huellas (He y col., 26; Li et al, 22.), la complejidad y la variación de los componentes químicos de las hierbas limitan su uso en la identificación de especies.

Por lo tanto, existe la necesidad de extracción y aislamiento de cimirracemato A para su uso posterior como agente terapéutico. Además, existe la necesidad de un marcador bioactivo que se pueda usar para identificar los elementos del género Cimidfuga, por ejemplo: C. racemosa, C. dahurica (Turcz.) Maxim., C. foetida L. y C. heradeifolia Kom. De forma ideal, el marcador bioactivo también se puede usar para normalizar extractos de especies de Cimidfuga para su uso en forma de agentes anti-inflamatorios para el tratamiento de enfermedades asociadas a la inflamación y para distinguir las especies en base al perfil químico de cada muestra.

Breve sumario

La presente invención proporciona materiales y procedimientos para aislar y extraer cimirracemato A de una especie Cimidfuga de acuerdo con las reivindicaciones anexas. El cimirracemato A aislado se puede usar en forma de composición terapéutica y / o en forma de suplemento dietético. Además, el cimirracemato A aislado se puede usar en forma de marcador químico bioactivo y normalizado para varias especies de Cimidfuga.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para purificar cimirracemato A, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una cantidad suficiente de material de una especie de Cimidfuga',

b) moler la materia prima;

c) mezclar el material molido con un disolvente polar acuoso a una temperatura de 2°C a 28°C para obtener un extracto de disolvente que comprende cimirracemato A, en el que el disolvente polar acuoso es agua o agua-etanol que comprende etanol a una concentración de menos del 2%; y

d) aislar el cimirracemato A.

De forma ventajosa, la presente invención proporciona rendimientos más altos y más constantes de cimirracemato A aislado partir de especies de Cimidfuga. El novedoso procedimiento de aislamiento de la presente invención también es más rápido y conveniente.

Se proporciona cimirracemato A aislado para su uso en el tratamiento de, por ejemplo, malestar, malaria, reumatismo, función renal anormal, dolor de garganta, irregularidades menstruales, enfermedades asociadas con el parto, fiebre, dolor de cabeza, escalofríos y así como los síntomas y / o síndromes asociados con estas afecciones.

Además, se proporciona cimirracemato A aislado que se puede usar en forma de agente anti-inflamatorio.

En una realización adicional, se pueden distinguir varias especies del género Cimidfuga. Los extractos de las diversas especies de Cimidfuga crean perfiles químicos individuales para la bioactividad del cimirracemato A.

En un aspecto, el cimirracemato A se puede usar en forma de marcador químico para normalizar productos de C. racemosa disponibles en el mercado. El uso de cimirracemato A en forma de marcador químico para normalizar productos de C. racemosa puede ser, por ejemplo, en base a la bioactividad de cimirracemato A en forma de agente anti-inflamatorio.

De forma ventajosa, mediante el uso del procedimiento de extracción mejorado de la presente invención es posible distinguir diferentes especies de cimidfuga y normalizar extractos usando cimirracemato A en forma de marcador químico para el uso potencial bioactivo de estas hierbas o productos relacionados como terapias alternativas o suplementos dietéticos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una estructura química... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de aislamiento de cimirracemato A de una especie Cimifuga, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una cantidad suficiente de materia prima de una especie Cimicifuga;

b) mezclar la materia prima de una especie Cimifuga con un disolvente polar acuoso a una temperatura de 2°C a 28°C para obtener un extracto de disolvente que comprende cimirracemato A, en el que el disolvente polar acuoso es agua o agua-etanol que comprende etanol a una concentración de menos del 2%; y

c) aislar cimirracemato A del extracto de disolvente.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el cimirracemato A es aislado del extracto de disolvente usando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el cimirracemato A es eluido usando HPLC del extracto de disolvente a absorbancia UV de 21 nm.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el cimirracemato A es eluido usando HPLC del extracto de disolvente a 23°C.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la materia prima de una especie Cimicifuga es molida para dar polvo.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la especie Cimicifuga es seleccionada del grupo que consiste en Cimicifuga racemosa, Cimicifuga foetida, y Cimicifuga heracleifolia, en el que, preferiblemente, la especie Cimicifuga es Cimicifuga racemosa.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el disolvente polar acuoso es agua - etanol que comprende etanol a una concentración menor del 2%.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la especie Cimicifuga es mezclada con agua - etanol en una relación de 1:15 a 1:2 (p / v).

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el disolvente polar acuoso es agua.

1. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la especie Cimicifuga es mezclada con agua en una relación

de 1:15 -1:2 (p / v).

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que Cimicifuga racemosa es mezclada con agua en una relación de 1:15 (p/v).

12. El procedimiento, de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en las etapas de:

a) proporcionar una cantidad suficiente de materia prima de una especie Cimicifuga',

b) mezclar la materia prima de una especie Cimifuga con un disolvente polar acuoso a una temperatura de 2°C a 28°C para obtener un extracto de disolvente que comprende cimirracemato A, en el que el disolvente polar acuoso es agua o agua-etanol que comprende etanol a una concentración menor del 2%; y

c) aislar cimirracemato A del extracto de disolvente.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el disolvente polar acuoso es agua.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la especie Cimicifuga es mezclada con agua en una relación de 1:15 -1:2 (p/v).

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende además la formulación del cimirracemato A aislado para dar una composición farmacéutica seleccionada entre comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pastillas, supositorios, soluciones orales, suspensiones, o una composición farmacéutica adaptada para su administración mediante inyección local a seres humanos, preferiblemente una composición seleccionada a partir de comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, o pastillas