Agrupación de genes de saxitoxina de cianobacterias y detección de organismos cianotóxicos.

Un método para detectar un organismo cianotóxico que comprende las etapas de obtener una muestra para usarse en el método y analizar la muestra para la presencia de una agrupación de genes SXT presente sólo en organismos productores de saxitoxina,

en el que dicho análisis comprende detectar:

(i) un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 36;

(ii) un polinucleótido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido de (i);

(iii) un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i);

(iv) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 37; o,

(v) un polipéptido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido de (iv),

y en el que dicha presencia es indicativa de organismos cianotóxicos en la muestra.

Agrupación de genes de saxitoxina de cianobacterias y detección de organismos cianotóxicos Campo Técnico La presente invención se refiere a métodos para la detección de cianobacterias, dinoflagelados, y en particular, a métodos para la detección de organismos cianotóxicos. Se proporcionan kits para la detección de cianobacterias, dinoflagelados, y organismos cianotóxicos. La invención se refiere además a métodos para cribar para compuestos que modulan la actividad de polinucleótidos y/o polipéptidos de las rutas biosintéticas de la saxitoxina y cilindrospermopsina.

Antecedentes Las cianobacterias, también conocidas como algas verdeazuladas, son bacterias fotosintéticas distribuidas ampliamente en entornos marinos y de agua dulce. Las cianobacterias que producen compuestos tóxicos son particularmente significativas para la calidad del agua y la salud humana y animal. En condiciones eutróficas, las cianobacterias tienden a formar grandes floraciones que promueven drásticamente concentraciones elevadas de toxinas. Las floraciones de cianobacterias pueden crecer mucho y expandirse en aguas costeras, arroyos, lagos y agua potable y reservorios recreacionales. Las toxinas que producen pueden plantear un riesgo de salud grave para los seres humanos y animales y este problema es relevante internacionalmente ya que las cianobacterias más tóxicas tienen una distribución global.

Es muy conocido un diverso rango de géneros de cianobacterias por la formación de floraciones de algas verdeazuladas tóxicas en superficies acuáticas. La saxitoxina (SXT) y sus análogos causan el síndrome de intoxicación paralizante por moluscos (PSP) , que aflige a la salud humana e impacta en las economías costeras de moluscos en todo el mundo. Las toxinas PSP son alcaloides únicos, que son producidas tanto por procariotas como eucariotas. Las toxinas PSP están entre las toxinas de algas más potentes y ubicuas y se consideran un riesgo toxicológico grave para la salud que puede afectar a los seres humanos, animales y ecosistemas en todo el mundo. Estas toxinas bloquean los canales de sodio y calcio regulados por voltaje y prolongan la apertura de los canales de potasio evitando la transducción de señales neuronales. Se ha estimado que cada año se producen globalmente más de 2.000 casos humanos de PSP. Además, las floraciones costeras de microorganismos productores resulta en millones de dólares de daño económico debidos a la contaminación por la toxina PSP de marisco y el requerimiento continuo de programas cotosos de monitorización de biotoxinas. Los sistemas de alerta temprana para anticipar las floraciones de algas productoras de la toxina paralizante de moluscos (PST) , tales como PCR y cribado basado en ELISA, todavía no están disponibles debido a la ausencia de datos sobre la base genética de la producción de PST.

SXT es un alcaloide de perhidropurina tricíclica que puede estar sustituida en varias posiciones dando lugar a más de 30 análogos de SXT naturales. Aunque la biosíntesis de SXT parece compleja y única, los organismos de dos reinos, incluyendo determinadas especies de dinoflagelados marinos y cianobacterias de agua dulce, son capaces de producir estas toxinas, aparentemente por la misma ruta biosintética. A pesar de esfuerzos considerables, no se ha identificado previamente ninguna de las enzimas o genes implicados en la biosíntesis y modificación de SXT.

La aparición del género de cianobacterias Cylindrospermopsis se ha documentado en todos los continentes y por lo tanto plantea una amenaza significativa para la salud pública a escala global. La toxina principal producida por Cylindrospermopsis es cilindrospermopsina (CYR) . Además de plantear una amenaza para la salud humana, la cilindrospermopsina también causa pérdidas económicas significativas para granjeros debido a la intoxicación del ganado con agua potable contaminada por cilindrospermopsina. La cilindrospermopsina tiene efectos hepatotóxicos, citotóxicos y neurotóxicos generales y es un carcinógeno potencial. Su toxicidad se debe a la inhibición de la síntesis de glutatión y proteínas así como a la inhibición del citocromo P450. Hasta ahora se han identificado seis especies de cianobacterias que producen cilindrospermopsina; Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon ovalisporum, Aphanizomerzon flos-aquae, Umezakia natans, Rhaphdiopsis curvata y Anabaena bergii. Los incidentes de intoxicación humana con cilindrospermopsina sólo se han reportado en Australia subtropical hasta la fecha, sin embargo C. raciborskiiand A. flos-aquae se han detectado recientemente en áreas con climas más templados. La tendencia de C. raciborskii para formar floraciones densas y la capacidad de invasión de los organismos productores da lugar a preocupaciones globales respecto a la calidad del agua potable y necesita la monitorización de las reservas de agua potable para detectar la presencia de productores de cilindrospermopsina.

Existe una necesidad de métodos rápidos y exactos que detecten cianobacterias, y en particular aquellas cepas que son capaces de producir cianotoxinas tales como saxitoxina y cilindrospermopsina. Se necesitan métodos rápidos y exactos para detectar organismos cianotóxicos para evaluar el peligro potencial para la salud de floraciones de cianobacterias y para la implementación de estrategias de gestión del agua eficaces para minimizar los efectos de brotes de floraciones tóxicas.

Resumen En un primer aspecto, se proporciona un polinucléotido aislado que comprende una secuencia según SEQ ID NO: 1

o una variante que comparte al menos 80% de identidad con SEQ ID NO: 1 o fragmento de ésta, en la que el

fragmento comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68.

En un segundo aspecto, se proporciona un ácido ribonucleico aislado o un ADN complementario aislado codificado por una secuencia según el primer aspecto.

En un tercer aspecto, se proporciona un polipéptido aislado de la ruta biosintética de la saxitoxina codificado por el fragmento del primer aspecto y que comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69.

En una realización, se proporciona una sonda o cebador que hibrida específicamente con uno o más de: un polinucleótido según el primer aspecto, un ácido ribonucleico o ADN complementario según el segundo aspecto, o un polipéptido según el tercer aspecto.

Se describe un vector que comprende un polinucleótido según el primer aspecto, o un ácido ribonucleico o ADN complementario según el segundo aspecto. El vector puede ser un vector de expresión.

Se describe una célula huésped que comprende el vector.

En otra realización, se proporciona un anticuerpo aislado capaz de unirse específicamente a un polipéptido según el tercer aspecto.

En un cuarto aspecto, se proporciona un método para detectar un organismo cianotóxico que comprende las etapas de obtener una muestra para usarse en el método y analizar la muestra para la presencia de una agrupación de genes SXT presente sólo en organismos productores de saxitoxina, en el que dicho análisis comprende detectar:

(i) un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 36;

(ii) un polinucleótido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido de (i) ;

(iii) un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i) ;

(iv) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 37; o,

(v) un polipéptido variante que tiene... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar un organismo cianotóxico que comprende las etapas de obtener una muestra para usarse en el método y analizar la muestra para la presencia de una agrupación de genes SXT presente sólo en organismos productores de saxitoxina, en el que dicho análisis comprende detectar:

(i) un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, y SEQ ID NO: 36;

(ii) un polinucleótido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polinucleótido de (i) ;

(iii) un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i) ;

(iv) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, y SEQ ID NO: 37; o,

(v) un polipéptido variante que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido de (iv) ,

y en el que dicha presencia es indicativa de organismos cianotóxicos en la muestra.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho organismo cianotóxico es una cianobacteria o un dinoflagelado.

3. El método según la reivindicación 1, en el que dicho análisis comprende la amplificación de ADN de la muestra por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando uno o más cebadores que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de cebador.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además analizar la muestra para la presencia de uno o más de:

(i) un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido,

(ii) un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i) ,

(iii) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polipéptido.

5. El método según la reivindicación 4, en el que dicho análisis comprende la amplificación de ADN de la muestra por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando uno o más cebadores que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias.

6. Un kit para la detección de organismos cianotóxicos, comprendiendo el kit al menos un agente para detectar la presencia de una agrupación de genes SXT presente sólo en organismos productores de saxitoxina, en el que bien:

(i) dicho agente puede detectar un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido y dicho agente es un cebador o una sonda;

(ii) dicho agente puede detectar un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i) y dicho agente es un cebador o una sonda; o

(iii) dicho agente puede detectar un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 37, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencia de polipéptido, y dicho agente es un anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido.

7. El kit según la reivindicación 6, en el que dicho al menos un agente es un cebador o sonda que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de nucleótidos.

8. El kit según la reivindicación 6 o reivindicación 7, que comprende además al menos un agente adicional para detectar la presencia de uno o más de:

(i) un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido,

(ii) un ácido ribonucleico o ADN complementario codificado por una secuencia según (i) , o,

(iii) un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, y SEQ ID NO: 110, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polipéptido.

9. El kit según la reivindicación 8, en el que dicho al menos un agente adicional es un anticuerpo, cebador o sonda, en el que dicho cebador o sonda comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o una secuencia de nucleótidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, y SEQ ID NO: 68.

11. Un ácido ribonucleico aislado o un ADN complementario aislado codificado por una secuencia según la reivindicación 10.

12. Un polipéptido aislado de la ruta biosintética de la saxitoxina codificado por un fragmento según la reivindicación 10 y que comprende una secuencia de aminoácidos que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 69.

13. Una sonda o cebador que hibrida específicamente con uno o más de:

(i) un polinucleótido según la reivindicación 10, o

(ii) un ácido ribonucleico o ADN complementario según la reivindicación 11,

en el que dicho cebador o sonda comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, y variantes que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con una cualquiera de dichas secuencias de polinucleótido.

14. Un anticuerpo aislado capaz de unirse específicamente a un polipéptido según la reivindicación 12.