Detección de cianobacterias hepatotóxicas.

Un método para la detección de cianobacterias productoras de microcistina y cianobacterias productoras denodularina,

comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) obtener una muestra de cianobacterias; y

(b) analizar la muestra para detectar la presencia de secuencias del dominio de aminotransferasa (AMT) asociadas ahepatotoxinas,

en el que dicho dominio AMT está localizado dentro de los marcos de lectura abiertos de mcyE y ndaF, y lapresencia de dichas secuencias del dominio AMT de la aminotransferasa asociadas a hepatotoxinas es indicativa dedichas cianobacterias productoras de microcistina y cianobacterias productoras de nodularina.

Detección de cianobacterias hepatotóxicas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos y kits para la detección de cianobacterias tóxicas, en particular de 5 cianobacterias que producen hepatotoxinas.

Antecedentes de la invención Las cianobacterias, también conocidas como algas verde-azuladas, son bacterias fotosintéticas ampliamente distribuidas a nivel mundial en entornos de agua salada y dulce. Las cianobacterias que producen compuestos tóxicos son especialmente importantes para la calidad del agua y para la salud humana y animal. Una diversa gama de géneros de cianobacterias son conocidos por formar florecimientos de algas verde-azuladas tóxicos sobre superficies de agua (véase, por ejemplo, Codd et al., 1999; Carmichael, 2001) . Muchos de estos florecimientos son perjudiciales para los seres humanos y los animales debido a que los organismos que forman el florecimiento producen hepatotoxinas y neurotoxinas, y a la capacidad de los florecimientos para crecer y expandirse en aguas costeras, arroyos, lagos y en el agua potable y depósitos de agua recreativos.

Son necesarios métodos rápidos para la detección precisa de cianobacterias tóxicas para permitir una evaluación del riesgo sanitario potencial de la formación de florecimientos de cianobacterias y para permitir la aplicación de estrategias de gestión del agua eficaces para minimizar los efectos de los brotes de florecimientos tóxicos.

Dos hepatotoxinas particularmente problemáticas son la microcistina y la nodularina. Ambas toxinas son inhibidoras de las proteínas de tipo eucariota fosfatasa 1 y 2A y, en vertebrados, la toxicidad está mediada por el transporte de las toxinas hacia el interior de los hepatocitos. La exposición aguda a cualquiera de las toxinas puede conducir a una insuficiencia hepática y la muerte en animales, incluyendo seres humanos. Además, la exposición subcrónica a la microcistina y la nodularina se asocia con la estimulación de turmores y, en el caso de la nodularina, al inicio de tumores (Hitzfeld et al., 2000) .

La microcistina y la nodularina son péptidos cíclicos sintetizados de forma no ribosómica por grandes complejos multienzimáticos que consisten en diferentes módulos que incluyen sintetasas peptídicas no ribosómicas (NRPS) y poliquetida sintasas (PKS) (Tillett et al., 2000; Moffitt y Neilan, 2001) . Estos módulos catalizan la activación, la modificación y la condensación de aminoácidos específicos. Las microcistinas forman una gran familia de heptapéptidos cíclicos con la fórmula general ciclo- (D-alanina-X-D-MeAsp-Z-Adda-D-glutamato-Mdha) , en la que D-MeAsp es ácido D-1-eritrometilaspartático, Mdha es N-metildeshidroalanina, y X y Z son L-aminoácidos variables. La nodularina es un pentapéptido cíclico con la fórmula general ciclo- (D-MeAsp-L-arginina-Adda-D-glutamato-Mdha) , en la que Mdhb es ácido 2- (metilamino) -2-deshidrobutírico. El resto más poco común de la microcistina y la nodularina es Adda (ácido 3-amino-9-metoxi-2, 3, 8-trimetil-10-fenil-4, 6-decadienoico) .

Las especies que producen microcistina normalmente producen un cóctel de diferentes variantes de microcistina, aunque sólo un tipo será sintetizado de modo predominante (Mikalsen et al., 2001) . Sólo se han identificado unos pocos variantes de la nodularina hasta ahora.

Hasta la fecha han aparecido informes acerca de la producción de microcistina por especies de cianobacterias de los cuatro órdenes Chroococcales, Nostocales, Oscillatoriales, y Stignonematales, que incluyen Microcystis sp., Chroococcus dispersus (Chroococcales) , Anahaena sp., Nostoc sp., Anabeanopsis sp. (Nostocales) , Haphalosiphon, Phormidium sp., Planktothrix sp., y Oscillatoria sp. Sin embargo, sólo se han indicado genes para la producción de nodularina en N. spumigena y en una cepa de N. harveyana (Moffitt y Neilan, 2001) .

Debido a esta amplia distribución de producción de hepatotoxinas y diferencias en la secuencia de los géneros de cianobacterias, no existen protocolos moleculares fiables que permitan la detección de todas las especies de cianobacterias que potencialmente producen hepatotoxinas. La mayoría de los métodos de detección basados en la PCR sólo se basan en la amplificación de las secuencias de los genes de la microcistina o nodularina sintetasa 45 procedentes de un género o de una especie (por ejemplo, Neilan, 1996; Moffitt et al., 2001; Tillet et al., 2000; Christiansen et al., 2003; Vaitomaa et al., 2003; Kurmayer et al., 2003, 2004) . Los protocolos basados en más de un conjunto de datos sólo se dirigen a las especies formadoras de florecimientos que producen microcistina más comunes Microcystis, Planktothrix, y Anabaena (Hisbergues et al., 2003) . La detección molecular de otras especies productoras de microcistina, tales como Anabaenopsis, Phormidium, y Nostoc, no se ha tratado previamente.

El documento WO 2004/104211 describe un método para detectar cianobacterias tóxicas mediante la detección de una región del gen mcyE, preferiblemente la región responsable de añadir Adda y D-glutamato al producto inmaduro de la síntesis de microcistina.

Ouahid et al. (2005) , Environ. Toxicol.m, 20 (3) :235-242, describen un método para detectar cianobacterias que producen microcistina que comprende amplificar un segmento del gen mcyE.

Por consiguiente, claramente es necesario el desarrollo de un sistema de detección sencillo para la identificación de múltiples especies y géneros de cianobacterias productoras de hepatotoxinas.

Los presentes inventores ahora han desarrollado un método molecular que permite la detección de todas las especies conocidas potencialmente productoras de microcistina y nodularina con una única reacción de PCR.

Sumario de la invención Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la detección de cianobacterias productoras de microcistina y cianobacterias productoras de nodularina, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) obtener una muestra de cianobacterias; y

(b) analizar la muestra para detectar la presencia de secuencias del dominio de aminotransferasa (AMT) asociadas a hepatotoxinas,

en el que dicho dominio AMT está localizado dentro de los marcos de lectura abiertos de mcyE y ndaF, yla presencia de secuencias del dominio AMT de la aminotransferasa asociadas a hepatotoxinas es indicativa de dichas cianobacterias productoras de microcistina y cianobacterias productoras de nodularina.

Las secuencias del dominio de aminotransferasa asociadas a hepatotoxinas pueden proceder del marco de lectura abierto de mcyE del complejo de genes de la microcistina sintetasa o de uno de sus ortólogos u homólogos y/o del marco de lectura abierto de ndaF del complejo de genes de la nodularina sintetasa o de uno de sus ortólogos u homólogos.

La etapa de análisis (b) puede comprender:

(i) la amplificación de ADN a partir de la muestra utilizando cebadores adecuados; y

(ii) la detección de secuencias amplificadas.

Los cebadores pueden ser cebadores oligonucleotídicos que comprenden las secuencias de nucleótidos indicadas en cualquiera de SEQ ID NO:1 a 4. En una realización, la amplificación puede realizarse utilizando la pareja de cebadores que comprende las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NO:1 y 2. En una realización, la amplificación puede realizarse utilizando la pareja de cebadores que comprende las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NO:1 y 4. En una realización, la amplificación puede realizarse utilizando la pareja de cebadores que comprende las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NO:3 y 4.

La detección de las secuencias amplificadas puede comprender una electroforesis en gel y/o una secuenciación de ácidos nucleicos.

La muestra de cianobacterias puede comprender uno o más organismos cianobacterianos aislados o cultivados, o puede ser una muestra extraída del entorno que contenga uno o más organismos cianobacterianos. La muestra extraída del entorno puede proceder de agua salada o de agua dulce. La muestra extraída del entorno puede ser una muestra de agua o una muestra de un florecimiento de algas verde-azuladas.

La descripción también se refiere a un método para la detección de cianobacterias productoras de hepatotoxinas, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) obtener una muestra de cianobacterias; y

(b) analizar la muestra para detectar la presencia de secuencias del dominio de aminotransferasa asociadas a hepatotoxinas,

en el que la presencia de secuencias del dominio de aminotransferasa asociadas a hepatotoxinas es indicativa de cianobacterias productoras de hepatotoxinas.

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1. Un método para la detección de cianobacterias productoras de microcistina y cianobacterias productoras de nodularina, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) obtener una muestra de cianobacterias; y

(b) analizar la muestra para detectar la presencia de secuencias del dominio de aminotransferasa (AMT) asociadas a hepatotoxinas,

en el que dicho dominio AMT está localizado dentro de los marcos de lectura abiertos de mcyE y ndaF, yla presencia de dichas secuencias del dominio AMT de la aminotransferasa asociadas a hepatotoxinas es indicativa de dichas cianobacterias productoras de microcistina y cianobacterias productoras de nodularina.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de análisis (b) puede comprender:

(i) la amplificación de ADN a partir de la muestra utilizando cebadores adecuados; y

(ii) la detección de secuencias amplificadas.

3. El método de la reivindicación 2, en el que los cebadores son cebadores oligonucleotídicos que comprenden las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NO:1 y 2.

4. El método de la reivindicación 2, en el que los cebadores son cebadores oligonucleotídicos que comprenden las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NO:1 y 4.

5. El método de la reivindicación 2, en el que los cebadores son cebadores oligonucleotídicos que comprenden las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NO:3 y 4.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que la detección de las secuencias amplificadas comprende una electroforesis en gel y/o una secuenciación de ácidos nucleicos.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra de cianobacterias comprende uno o más organismos cianobacterianos aislados o cultivados.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra de cianobacterias comprende una muestra extraída del entorno que contiene uno o más organismos cianobacterianos.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la muestra extraída del entorno es una muestra de agua salada o de agua dulce.

10. El método de la reivindicación 8, en el que la muestra extraída del entorno es una muestra de un florecimiento de algas verde-azuladas.

11. Un kit para la detección de cianobacterias productoras de microcistina y cianobacterias productoras de nodularina, comprendiendo dicho kit una pareja de cebadores diseñados para la amplificación con PCR de secuencias del dominio de aminotransferasa asociadas a hepatotoxinas en los genes ndaF y mcyE.

12. El kit de la reivindicación 11, en el que los cebadores son cebadores oligonucleotídicos que comprenden las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NO:1 y 2.

13. El kit de la reivindicación 11, en el que los cebadores son cebadores oligonucleotídicos que comprenden las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NO:1 y 4.

14. El kit de la reivindicación 11, en el que los cebadores son cebadores oligonucleotídicos que comprenden las secuencias de nucleótidos indicadas en SEQ ID NO:3 y 4.