Administración terapéutica del péptido antiangiogénico mezclado C16Y.

Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:

1 para su uso en el tratamiento de una condición asociada con neovascularización ocular.

Administración terapéutica del péptido antiangiogénico mezclado C16Y.

Campo de la invención 5

La presente invención se refiere al campo de las enfermedades oculares, en particular de enfermedades asociadas con neovascularización ocular.

Antecedentes 10

La matriz extracelular (ECM) , a menudo denominada como tejido conectivo, es la compleja estructura que rodea y da soporte a las células en tejidos de mamíferos. Se compone principalmente de tres clases de biomoléculas: proteínas estructurales (colágeno y elastina) , proteínas especializadas (por ejemplo, laminina, fibronectina, fibrilina) y proteoglicanos (proteínas del núcleo enlazadas a repeticiones de disacáridos conocidas como glicosaminoglicanos o 15 GAG) (Pepper, 2001) . La ECM es vital para el mantenimiento y la diferenciación de muchos tipos de células, incluyendo el endotelio. Además, desempeña un papel en la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes, un proceso conocido como angiogénesis (Folkman 1995; Risau 1997) .

La mayoría de las células normales no pueden sobrevivir a menos que estén ancladas a la ECM. Este anclaje está 20 mediado por glicoproteínas transmembrana heterodiméricas denominadas integrinas, que actúan como receptores de adhesión celular. Las integrinas están compuestas de subunidades α y β no asociadas covalentemente. Dieciséis subunidades α y ocho subunidades β han sido identificadas, y se han encontrado más de 20 combinaciones diferentes de estas subunidades. Por ejemplo, la integrina αvβ3 es un receptor en la superficie de las células endoteliales en los vasos sanguíneos en crecimiento. Se enlaza a las células endoteliales angiogénicas, lo que les permite formar nuevos 25 vasos sanguíneos. Las células anclan las integrinas a sus alrededores por mediación de la matriz celular y de interacciones célula-célula. La porción extracelular de la integrina se enlaza al colágeno, laminina o fibronectina, mientras que la porción intracelular se enlaza a filamentos de actina o al citoesqueleto. El enlazamiento extracelular a proteínas de matriz depende en gran medida del reconocimiento de un motivo RGD en las proteínas extracelulares. La fibronectina es la proteína prototipo que contiene RGD. 30

La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes. En condiciones normales, la angiogénesis está sujeta a estrecha regulación fisiológica, y la proliferación de células endoteliales es muy baja. Un aumento de angiogénesis normalmente se produce en la cicatrización de heridas, el desarrollo embrionario y el crecimiento mensual del revestimiento uterino en las hembras menstruando. Sin embargo, hay otras situaciones en las 35 que el aumento de la angiogénesis está asociado con una condición patológica. La angiogénesis descontrolada se ha asociado con el crecimiento tumoral, metástasis tumoral, retinopatía diabética, artritis reumatoide, y enfermedad cardiovascular (Folkman 1995) .

Las células endoteliales que forman los vasos sanguíneos en general permanecen en un estado de reposo hasta que 40 reciben una señal angiogénica de su microambiente. Estas señales pueden ser provocadas por heridas, inflamación o enfermedad. La señal angiogénica activa el endotelio y provoca una cascada de eventos que conducen a la formación de nuevos vasos: inducción de proteasas, degradación de la membrana basal, migración de células endoteliales en el espacio intersticial, proliferación de células endoteliales, formación del lumen, generación de nueva membrana basal, fusión de nuevos vasos, e inicio del flujo sanguíneo. 45

La primera etapa en la cascada angiogénica es la liberación de proteasas tales como las metaloproteinasas de matriz (MMP) por las células endoteliales. Estas proteasas degradan la membrana basal, un tipo especializado de ECM. La membrana basal es un depósito de almacenamiento para muchos factores de crecimiento angiogénicos, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) . La 50 degradación de la membrana basal libera estos factores de crecimiento angiogénico, que a su vez propaga la cascada angiogénica. La degradación de la ECM también resulta en la liberación de fragmentos de proteínas de la ECM, varios de los cuales han sido implicados en la modulación de la angiogénesis. Algunos de estos fragmentos (por ejemplo, un fragmento de trombospondina Mw 25.000) promueven la angiogénesis, mientras que otros fragmentos (por ejemplo, derivados de endostatina a partir de colágeno XVIII, angiostatina derivada de plasminógeno, los dominios no 55 colagenosos del colágeno IV, y varios péptidos de trombospondina) la inhiben (Taraboletti 2000; O'Reilly 1997; O'Reilly 1994; Maeshima 2001; Tolsma 1993) .

Las células endoteliales en los vasos sanguíneos están en contacto con una membrana basal que contiene laminina, una gran glicoproteína ubicua que existe en doce isoformas diferentes. La laminina se compone de tres cadenas (α, β y 60 γ) . Se han identificado cinco cadenas diferente α, tres β, y tres γ. Diez de los doce isoformas heterotriméricas diferentes contienen la cadena γ1 (Timpl 1994; Burgeson 1994; Miner 1997) . La identidad de las isoformas de laminina presentes en la matriz endotelial celular no se ha determinado. Sin embargo, los anticuerpos policlonales para laminina 1 (compuestos por α1, β1, y γ1) reconocen la matriz, lo que sugiere la presencia de al menos una de estas tres cadenas. La laminina 1 promueve la unión de células endoteliales in vivo, y las células se diferencian en estructuras similares a 65 capilares cuando se siembran sobre una membrana basal rica en laminina 1, tal como Matrigel (Kubota 1988) . Se han identificado múltiples sitios de enlazamiento para células tumorales en laminina 1 (Nomizu 1995; Nomizu 1997; Nomizu 1998) .

Más de veinte péptidos de laminina 1 han sido identificados que pueden promover angiogénesis in vivo (Malinda 1999; Ponce 1999) . Estos incluyen ocho péptidos de la cadena α1, cinco de la cadena β1, y siete de la cadena γ1. Dos de los 5 sitios de péptidos angiogénicos más potentes, A13 y C16, son sitios angiogénicos redundantes presentes en regiones homólogas de las cadenas α1 y γ1, respectivamente (Ponce 2003a; Kuratomi 2002; Kuratomi 1999) . Estas secuencias de péptidos se enlazan a la integrinas de células endoteliales αvβ3 y α5β1, y se ha demostrado que promueven adhesión, formación del tubo, y angiogénesis en el ensayo de la membrana corioalantoidea (CAM) de pollo (Ponce 2001) . El mecanismo de acción de estos péptidos aún no ha sido identificado. Aunque se enlazan a integrinas, no 10 parece que señalen a través de proteína quinasa activada por mitógeno o varias serina o treonina quinasas. Once de las trece proteínas laminina contienen cadenas γ1, lo que significa que la secuencia C16 está presente en once lamininas (Colognato 2001) . Además, la secuencia A13 está altamente conservada en las cadenas α de laminina. Esto significa que varias de las lamininas, incluyendo laminina 1 y laminina-3, contienen la secuencia A13 dos veces (Nomizu 2001) .

Debido a la importancia putativa de la secuencia C16 en la angiogénesis y sus enfermedades relacionadas, ha sido importante para identificar antagonistas capaces de bloquear su actividad. Uno de tales antagonistas es la secuencia perturbada del péptido C16S, que se ha demostrado que inhibe la angiogénesis inducida por bFGF y C16 en el ensayo de la CAM (Ponce 2001) . Los métodos descritos en la presente invención utilizan una secuencia modificada del péptido C16, C16Y, que es al menos cinco veces más potente que C16S. C16Y inhibe la neovascularización coroidea (CN) in 20 vivo, además de inhibir la angiogénesis in vivo y el crecimiento tumoral en ratones (Ponce 2003b) . Con base en la determinación de su secuencia activa mínima, C16Y ha demostrado que comparte homología con la fibronectina.

La angiogénesis no regulada se asocia con el cambio de los tumores desde un estado inactivo hasta un estado maligno. Los tumores requieren una extensa red capilar para crecer y producir metástasis. Normalmente, un tumor sólido no 25 crecerá más allá aproximadamente de 2 mm sin el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis patológica o no regulada en el ojo (neovascularización ocular) es la causa más común de ceguera, y ha sido implicada en aproximadamente veinte diferentes enfermedades de los ojos. Los principales tipos de neovascularización ocular son la neovascularización de la retina, neovascularización coroidea, neovascularización corneal, y neovascularización del iris.

La neovascularización... [Seguir leyendo]

1. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 para su uso en el tratamiento de una condición asociada con neovascularización ocular.

2. Un péptido con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5 para su uso en el tratamiento de una condición asociada con neovascularización ocular.

3. Un péptido para uso como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha neovascularización 10 ocular es la neovascularización coroidea; preferiblemente en donde dicha condición es la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) o alta miopía.

4. Un péptido para uso como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha neovascularización ocular es neovascularización de la retina; preferiblemente en donde dicha condición es retinopatía diabética, retinopatía 15 del prematuro, u oclusión de la vena central.

5. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha neovascularización ocular es neovascularización del iris; preferiblemente en donde dicha condición es glaucoma neovascular.

6. Un péptido para uso como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en donde dicho péptido comprende además una modificación; preferiblemente en donde dicha modificación se selecciona de entre el grupo que consiste en la adición de un dominio Fc de un anticuerpo, pegilación, acilación, biotinilación, acetilación, formilación, ubiquitinación, amidación, marcación enzimática, y marcación radioactiva.

7. Un péptido para uso como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en donde dicho péptido comprende uno o más aminoácidos de forma D.

8. Un péptido para uso como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en donde dicho péptido contiene una amida N-terminal. 30

9. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de enfermedades oculares asociadas con la neovascularización ocular que comprende un péptido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

10. Una composición farmacéutica para uso como se reivindica en la reivindicación 9 en donde dicho péptido es un péptido con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, y SEQ ID NO: 5.