Vectores para la preparación de composiciones inmunoterapéuticas.

Uso de:

a) un transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas,

leucemia o linfoma, situado bajo el control deseñales reguladoras de transcripción y expresión,

b) una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origenretroviral o similar a retroviral, y

c) regiones de iniciación central de acción en cis (cPPT) y de terminación de acción en cis (CTS) que puedenadoptar una estructura de tres cadenas tras transcripción inversa, siendo estas regiones de origen lentiviral,en la preparación de un vector.

Vectores para la preparación de composiciones inmunoterapéuticas La presente solicitud se refiere al uso de vectores retrovirales, y especialmente a vectores lentivirales para la preparación de composiciones que son capaces de inducir o contribuir a que tenga lugar o la mejora de una reacción inmunológica in vitro, y en una realización preferida in vivo, frente a epítopos que son codificados por secuencias de nucleótidos presentes en los vectores.

Los inventores han mostrado que los vectores preparados según la presente invención permiten obtener una respuesta inmune mediada por células, especialmente una reacción de linfocitos T citotóxicos (LTC) frente a epítopos.

La invención se refiere al uso de (a) un transgén que codifica uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma, situado bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, (b) una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, y (c) regiones de iniciación central de acción en cis (cPPT) y de terminación de acción en cis (CTS) que pueden adoptar una estructura de tres cadenas tras transcripción inversa, siendo estas regiones de origen lentiviral e insertándose en una orientación funcional con respecto a las señales reguladoras de origen retroviral o similar a retroviral mencionadas anteriormente, en la preparación de un vector.

Además han obtenido datos que muestran que esta respuesta inmune mediada por células puede ser una respuesta específica, obtenida frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de nucleótidos contenidos en los vectores.

También la solicitud da a conocer medios que podrían utilizarse para el tratamiento o profilaxis de enfermedades infecciosas, especialmente enfermedades asociadas con infección por virus y por ejemplo, con infección por retrovirus.

Los inventores además han obtenido resultados que muestran que la respuesta inmune mediada por células y especialmente la respuesta LTC asociada con el tratamiento mediante las composiciones de la invención puede ser específica para el antígeno del tumor o del virus o células infectadas por el virus, y también puede limitarse a moléculas específicas del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad) .

Particularmente la solicitud se refiere al uso de los vectores en composiciones inmunógenas, con el fin de obtener una respuesta inmune mediada por células limitada a las moléculas de clase I del complejo CMH y por ejemplo limitada a moléculas HLA-A2 o B7.

En consecuencia, la solicitud describe una composición inmunógena que comprende un vector recombinante que comprende un polinucleótido que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS) . Durante la transcripción inversa, las secuencias cPPT y CTS inducen la formación de una estructura de ADN de tres cadenas denominada aquí en el presente documento como ADN tricatenario. El ADN tricatenario estimula la importación nuclear de genomas del ADN del vector, siendo estas regiones de origen lentiviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de nucleótidos definida (transgén o 45 secuencia de interés) y señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen lentiviral, en el que la composición es capaz de inducir o estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) o de CD4 frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector.

En una realización preferida, la respuesta inmune mediada por células y especialmente la respuesta de LTC o la respuesta de CD4 frente a uno o varios epítopos es una respuesta de LTC o de CD4 de memoria.

Se enfatiza que la presencia, en el vector, de las regiones cPPT y CTS permiten que de ese modo se forme una estructura de ADN tricatenario influyendo y especialmente mejorando la importación nuclear del genoma del vector en células recombinadas con dicho vector.

Esta capacidad de la composición inmunógena para inducir, mejorar o en general para asociarse a los acontecimientos de la respuesta de LTC de memoria, permite proponer el uso de la composición inmunógena en los protocolos de terapia antitumoral o terapia antivírica o antipatógena, incluyendo si la respuesta inmune tiene que inducirse en un largo periodo de tiempo o ser al menos inducible cuando se busca una respuesta en un periodo de tiempo que puede ser inducción a largo plazo de la respuesta, tras la administración de la composición inmunógena. En otras palabras, puede usarse la composición inmunógena para la preparación de composición terapéutica para el tratamiento de enfermedades tumorales o participando en la aparición de una respuesta inmune mediada por células, especialmente una respuesta de LTC o una respuesta de memoria.

Se enfatiza que la composición inmunógena, como consecuencia de la presencia de la estructura tricatenaria en la secuencia del vector, que resulta de la presencia de las regiones CTS y cPPT en el vector y en las partículas del

La presenta solicitud describe también el uso de una secuencia nucleotídica que comprende las secuencias CTS y 5 cPPT de origen lentiviral o sintético para aumentar la entrada de las secuencias de nucleótidos o de péptidos en el núcleo de las células diana o células receptoras.

Como ejemplo, se entiende que dicha secuencia de triple cadena comprende secuencias ajenas o secuencias propias con respecto a las células receptoras.

Por tanto, la solicitud describe una composición que podría utilizarse en protocolos terapéuticos que presentan analogías con los protocolos de vacunación, para el tratamiento de tumores y especialmente como tratamiento antineoplásico y anti enfermedades infecciosas.

Es interesante observar que de acuerdo con la presente invención este transgén o secuencia de interés puede ser una secuencia que codifique uno o varios epítopos de una o varias células tumorales de carcinomas, leucemia o linfoma, por ejemplo epítopos que se han identificado en antígenos diana potenciales para la inducción de una respuesta inmune mediada por células contra carcinomas, leucemia o linfoma.

Varios epítopos que forman un múltiple epítopo, pueden codificarse por el transgén de la invención. En una realización particular, pueden derivar de antígenos diana identificados en estos tumores, y pueden seleccionarse de tal modo que cuando su secuencia codificante se combine para formar el transgén, se obtenga una respuesta inmune mediada por células contro todos los epítopos o contra la mayoría de ellos. Puede ensayarse la respuesta inmune mediada por células in vitro o en una realización preferida in vivo. Los protocolos que permiten llevar a cabo tales ensayos se describen en los ejemplos.

Se han identificado antígenos diana en varios tipos de tumores. Dentro de la presente invención, el o los epítopos son de carcinomas, incluyendo carcinomas renales, carcinomas de vejiga, carcinomas de colon, carcinomas de pulmón, cáncer de mama, leucemia y linfoma.

Se añade también que los vectores preparados según la invención que se utilizan en las composiciones inmunógenas pueden expresar epítopos o pueden estar presentes en proteínas (incluyendo glucoproteínas u otros compuestos derivados de proteínas) identificadas como antígenos diana en las células tumorales anteriormente mencionadas.

Además, se observa que epítopos, polipéptidos o proteínas utilizadas para proporcionar epítopos, pueden modificarse, por ejemplo mediante mutación, deleción o inserción y por ejemplo pueden modificarse para mejorar su estabilidad.

La solicitud desvela también una composición inmunógena que comprende partículas retrovirales recombinantes que comprenden:

1) una secuencia de nucleótidos recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos definida (transgén) , situada bajo el control de las señales reguladoras de la transcripción y expresión, señales reguladoras de la 45 retrotranscripción , expresión y encapsidación y, 2) un polinucleótido que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS) , siendo estas regiones de origen lentiviral e insertándose en una localización y orientación funcionales con señales reguladoras de retrotranscripción de origen retroviral o similar a retroviral o señales reguladoras de transposones,

en la que la composición inmunógena es capaz de inducir o de estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector.

1. Uso de: a) un transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma, situado bajo el control de

señales reguladoras de transcripción y expresión, b) una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, y c) regiones de iniciación central de acción en cis (cPPT) y de terminación de acción en cis (CTS) que pueden adoptar una estructura de tres cadenas tras transcripción inversa, siendo estas regiones de origen lentiviral,

en la preparación de un vector.

2. Usosegún la reivindicación 1, en el quedichosunoovarios epítopos codificande8a15 aminoácidos, preferentemente de 9 a 12 aminoácidos.

3. Uso según la reivindicación 1 o 2, en el que dichos epítopos de carcinomas son de carcinomas renales, carcinomas de vejiga, carcinomas de colon, carcinomas de pulmón o cáncer de mama.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que dichas secuencias de señales reguladoras de origen retroviral se derivan de un genoma de lentivirus. 20

5. Uso según la reivindicación 1, en el que dichas secuencias de señales reguladoras de origen similar a retroviral se derivan de un retrotransposón.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho transgén está contenido en un casete de 25 expresión que incluye señales reguladoras de transcripción y expresión.

7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichas señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación son de origen lentiviral, y dichas regiones de cPPT y de CTS son de origen lentiviral.

8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación y dichas regiones de cPPT y de CTS, se derivan de un lentivirus seleccionado de CAEV, EIAV, VISNA, VIH, VIS o VIF.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que dichas señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación y dichas regiones de cPPT y de CTS se derivan de un retrovirus de tipo VIH, en particular VIH-1 o VIH-2.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichas regiones de cPPT y de CTS tienen una 40 localización central dentro de la secuencia del vector.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho transgén se inserta en la región U3 de las señales de regulación para retrotranscripción.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, enelque dichovector esadecuadoparainducir o estimular una respuesta inmune mediada por células contra uno o varios epítopos codificados por dicho transgén.

13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, enelque dichovector esadecuadoparainducir o estimular una respuesta inmune mediada por células contra todos o la mayoría de los epítopos contenidos en el 50 poliepítopo.

14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, enelque dicho vector es adecuado para inducir o estimular una respuesta inmune mediada por células contra el tumor que expresa dichos uno o varios epítopos.

15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicha respuesta inmune es una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) o una respuesta de CD4.