Variantes del alérgeno mayor PHI P 1 de hierba timotea.

Variante del alérgeno mayor PhI p 1 de hierba timotea caracterizada porque presenta un resto Cys adicionalrespecto al tipo salvaje en una posición de aminoácido superior a 140,

caracterizada porque el tipo salvajepresenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEC ID Nº 2, en la que esta secuencia deaminoácidos del tipo salvaje es, no obstante, distinta a la secuencia de aminoácidos según SEC ID Nº 2 en laque presenta un resto Ala en la posición de aminoácido 236.

Variantes del alérgeno mayor PHI P 1 de hierba timotea La invención se refiere a variantes del alérgeno mayor PhI p 1 de hierba timotea caracterizadas porque se puede realizar una preparación hasta ahora no posible de moléculas monoméricas, solubles en medios fisiológicos y 5 estables con ayuda de sistemas de expresión procariotas y su posterior purificación.

Antecedentes de la invención Las alergias del tipo 1 tienen importancia en todo el mundo. Hasta el 25% de la población de los países industrializados sufre de dolencias, como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial, provocadas por alérgenos que se encuentran en el aire (aeroalérgenos) , que son liberados por diferentes fuentes, como polen vegetal, ácaros,

gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de tipo 1 muestran además reactividad IgE (inmunoglobulina E) específica con alérgenos del polen de gramíneas (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-201) .

Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción a través de las mucosas estos alérgenos reaccionan con las moléculas IgE que están unidas a la superficie de los mastocitos. Cuando dos moléculas de IgE se enlazan a través de un alérgeno se produce la liberación de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas mediante las células efectoras y con ello se desencadenan los correspondientes síntomas clínicos.

Dependiendo de la frecuencia relativa de alérgicos que presentan anticuerpos IgE contra determinados alérgenos, se diferencia entre alérgenos mayores y menores. En el caso de la hierba timotea (Phleum pratense) , se han caracterizado hasta el momento Phl p 1 (Petersen y col., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92, 789-796) , Phl p 5

(Matthiesen y Löwenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21, 297-307) , Phl p 6 (Petersen y col., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54) y Phl p 2/3 (Dolecek y col., 1993) como alérgenos mayores y Phl p 4 (Löwenstein, 1978, Prog. Allergy 25, 1-62) , así como los grupos 10 y 11 de Lolium perenne (Ansari y col., 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 80, 229-235) como alérgenos menores.

Se ha clasificado el grupo 1 como uno de los grupos de alérgenos más relevantes de polen de gramíneas (Tamborini, E. y col., Eur. J. Biochem. 1997, 249:886-894) , al cual pertenece PhI p 1 de hierba timotea. Los demás representantes del grupo 1 de otras gramíneas presentan homología parcial por encima del 95% con PhI p 1 (Petersen, A., y col., J. Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-994) . A causa de la elevada homología, en la sensibilización con una gramínea también aparecen reacciones en los alérgenos de otras especies con reactividad cruzada. Por eso, estas moléculas tienen una gran importancia para las aproximaciones diagnósticas y

terapéuticas.

Para el uso terapéutico de estos alérgenos se utiliza la reacción con células T auxiliares en las que se han reorientado las células TH2 patológicas a un tipo TH1. Con ello se consigue una modificación del perfil de citoquina de modo que se estimula la unión de células B con IgG en lugar de IgE.

La inmunoterapia específica o hiposensibilización representa una aproximación clásica al tratamiento terapéutico eficaz de las alergias (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6) , 336-339, Bousquet y col., 1998, J. Allergy Clin Immunol. 102 (4) , 558-562) . Así, se inyectan de forma subcutánea a los pacientes extractos de alérgenos naturales en dosis crecientes.

No obstante, con este método existe el peligro de reacciones alérgicas o incluso de un choque anafiláctico. Para minimizar estos riesgos se emplean preparados innovadores en forma de alergoides. Se trata de extractos de alérgenos modificados químicamente que presentan una reactividad IgE claramente reducida, aunque presentan idéntica reactividad frente a células T en comparación con el extracto no tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7) , 377382) .

Sería posible una optimización aún más amplia de la terapia con alérgenos preparados de forma recombinante. Cócteles definidos, dado el caso ajustados a pacientes individuales, de alérgenos recombinantes de elevada pureza 45 podrían reemplazar a los extractos de fuentes de alérgenos naturales, ya que éstos, aparte de los diferentes alérgenos, contienen una gran cantidad de proteínas acompañantes inmunogénicas pero no alergénicas.

Perspectivas realistas, que podrían conducir a una hiposensibilización segura con productos de expresión, ofrecen alérgenos recombinantes mutados dirigidos en los cuales se han eliminado de forma específica epítopos IgE, sin perjudicar a los epítopos de células T esenciales para la terapia (Schramm y col., 1999, J. Immunol. 162, 24062414) .

Otra posibilidad para influenciar terapéuticamente sobre el equilibrio alterado de células T auxiliares en los alérgicos es el tratamiento con ADN capaz de expresarse que codifica para los alérgenos relevantes. Las primeras pruebas 5 experimentales de la influencia alergenoespecífica de la respuesta inmune se obtuvieron en roedores mediante la inyección de ADN codificante de alérgeno (Hsu y col., 1996, Nature Medicine 2 (5) , 540-544) .

En el caso de Phl p 1, se trata de una proteína de 240 aminoácidos y un punto de glicosilación N. La proporción de glicosilación asciende a un 5% del peso molecular, el cual en el caso de la proteína natural asciende a aproximadamente 30-35 kDa (Petersen y col., Allergy Clin. Immunol. 1995, 95: 987-994; Suck y col., J. Immunol.

Meth. 1999, 229:73-80) .

Se conoce la secuencia de ácidos nucleicos de PhI p 1 (Laffer y col., J. Allergy Clin Immunol. 1994, 94: 689-698; Petersen y col., J. Allergy Clin. Immunol., 1995; 95: 987-94) y, por tanto, puede utilizarse para la preparación recombinante de la molécula.

No obstante, los anteriores intentos de preparación recombinante de la molécula en sistemas bacterianos o eucariotas, como p. ej. levaduras, de modo que se obtenga una forma monomérica estable no han tenido éxito a causa de su falta de solubilidad.

En el caso de la expresión bacteriana, PhI p 1 se deposita en forma de cuerpos de inclusión (inclusion bodies) (Vrtala y col., J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 97: 781-7) y debe desnaturalizarse al principio antes de la purificación. A continuación, se extrae el medio desnaturalizante. Sin embargo, hasta ahora no se ha podido conseguir un replegamiento completo de la proteína en la conformación soluble natural (Andersson, Lidholm, Int. Arch. Allergy Immunol. 2003;130:87-107) .

Un posible motivo de impedimento para la formación de una conformación estable podría haber sido la ausencia de la glicosilación. Sin embargo, no se obtuvo ningún Ph p 1 estable ni en sistemas eucariotas, en los que es posible la glicosilación (K. Grobe, Tesis doctoral, 1998, Universidad de Hamburgo) .

Por el contrario, como una causa de la nula solubilidad se supone una actividad proteolítica que conduce a la autodegradación de la molécula (Grobe y col., Eur. J. Biochem. 1999; 263: 33-40; Kirsten Gehlhar, Tesis doctoral, 1998, Universidad de Medicina de Lübeck, Alemania) . Además, como causa de la agregación también entran en consideración interacciones hidrofóbicas entre las moléculas.

Por consiguiente, el objetivo en el que se basa la presente invención consiste en la preparación de variantes del

alérgeno mayor PhI p 1 de hierba timotea que se caracterizan por una solubilidad mejorada con el mantenimiento de las características inmunológicas significativas desde un punto de vista terapéutico y diagnóstico y que pueden, por tanto, purificarse de una forma farmacéuticamente apropiada.

Figuras Figura 1: SDS-PAGE de nPhl p 1 (n=natural) de tipo salvaje, así como de las variantes de plegamiento LM y HM de las variantes de alérgeno rPhl p 1-A236C (r = recombinante) en condiciones reductoras (en presencia de ditiotreitol DTT) y no reductoras (sin DTT) .

Trayectoria 1: Patrones de peso molecular (10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 160, 220 kDa, Bench Mark Protein Ladder, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania)

Trayectoria 2: Extracto de polen de Phleum pratense Trayectoria 3: nPhl p 1

Trayectoria 4: rPhl p 1-LM

Trayectoria 5: rPhl p 1-HM

Figura 2: Filtración en gel con rPhl p 1-HM y rPhl p 1-LM en una columna Sephacr y l S100.

La figura muestra que ambas variantes de plegamiento presentan distintos pesos moleculares aparentes.

Figura 3: Enzym-Allergo-Sorbent-Test (EAST) para la cuantificación de la unión a IgE de las variantes de plegamiento rPhl p 1-A236C -LM y -HM

En el eje horizontal se... [Seguir leyendo]

1. Variante del alérgeno mayor PhI p 1 de hierba timotea caracterizada porque presenta un resto Cys adicional respecto al tipo salvaje en una posición de aminoácido superior a 140, caracterizada porque el tipo salvaje presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a SEC ID Nº 2, en la que esta secuencia de aminoácidos del tipo salvaje es, no obstante, distinta a la secuencia de aminoácidos según SEC ID Nº 2 en la que presenta un resto Ala en la posición de aminoácido 236.

2. Variante de alérgeno según la reivindicación 1, caracterizada porque se encuentra un resto Cys adicional entre las posiciones de aminoácido 230 y 240.

3. Variante de alérgeno según la reivindicación 1 o 2 caracterizada porque el resto Cys adicional procede de un intercambio de aminoácido.

4. Variante de alérgeno rPhl p 1-A236C según SEC ID Nº 2 según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 3 caracterizada porque el resto Cys adicional se ha introducido mediante el intercambio de Ala 236.

5. Molécula de ADN que codifica para una variante de alérgeno según una o varias de las reivindicaciones de la 15 1 a la 4.

6. Molécula de ADN según SEC ID Nº 1 que codifica para la variante de alérgeno según la reivindicación 4.

7. Procedimiento para la preparación de una variante del alérgeno mayor rPhI p 1 según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4 caracterizado porque según los métodos ya conocidos

-se introduce en el gen correspondiente un triplete de bases mediante inserción o intercambio que codifica 20 para un resto Cys,

- el gen así modificado se sobreexpresa en un organismo huésped y

- se purifica la variante de alérgeno obtenida mediante sobreexpresión.

8. Procedimiento para la preparación y purificación de una variante del alérgeno mayor recombinante rPhI p 1 según la reivindicación 7 en forma soluble, caracterizado porque al inicio la proteína cruda insoluble se desnaturaliza, a continuación se renaturaliza mediante dilución y se purifica mediante etapas de purificación bioquímicas.

9. Procedimiento para la purificación de una variante del alérgeno mayor recombinante rPhI p 1 según la reivindicación 7 en forma soluble, caracterizado porque partiendo de la proteína inicialmente insoluble sobreexpresada provista de una etiqueta His con fines de purificación se realizan varias etapas de purificación bioquímica que incluyen una cromatografía de afinidad con quelato de iones metálicos en dos etapas y la disociación de la etiqueta His.

10. Variante de alérgeno según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada porque se presenta en distintas formas de plegamiento.

11. Forma de plegamiento rPhl p 1 -LM de la variante de alérgeno según una o varias de las reivindicaciones de la 35 1 a la 4 que se obtiene mediante la realización de las siguientes etapas del procedimiento:

- Sobreexpresión de la variante de alérgeno rPhI p 1 provista de una etiqueta His en un organismo huésped

- Desnaturalización de los cuerpos de inclusión aislados del organismo huésped con cloruro de guanidinio

- Renaturalización de la proteína disuelta en una columna cromatográfica de afinidad con quelato

- Disociación de la etiqueta His

-Filtración en gel

- Nueva cromatografía de afinidad con quelato

- Aislamiento de la proteína objetivo del flujo

-Filtración en gel

12. Forma de plegamiento rPhl p 1 -HM de la variante de alérgeno según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4 que se obtiene mediante la realización de las siguientes etapas del procedimiento:

- Sobreexpresión de la variante de alérgeno rPhI p 1 provista de una etiqueta His en un organismo huésped

- Desnaturalización de los cuerpos de inclusión aislados del organismo huésped con cloruro de guanidinio

- Renaturalización de la proteína disuelta en una columna cromatográfica de afinidad con quelato

- Disociación de la etiqueta His

-Filtración en gel

- Nueva cromatografía de afinidad con quelato

- Elución de la proteína objetivo con un gradiente de imidazol

-Filtración en gel

13. Variante de alérgeno según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4 y de la 10 a la 12 como medicamento.

14. Uso de una variante de alérgeno según la reivindicación 13 y/o sus derivados farmacéuticamente aplicables, incluidas sus mezclas en todas proporciones, para la preparación de un medicamento para la inmunoterapia específica de alergias en cuya activación participa el alérgeno mayor PhI p 1 de hierba timotea.

15. Preparación farmacéutica que contenga una variante de alérgeno según la reivindicación 13 y/o sus derivados farmacéuticamente aplicables, incluidas sus mezclas en todas proporciones, así como, dado el caso, excipientes y/o coadyuvantes.

16. Uso de una variante de alérgeno según una o varias de las reivindicaciones de la 1 a la 4 y de la 10 a la 12 y/o sus derivados, incluidas sus mezclas en todas proporciones, para el diagnóstico in vitro de alergias en cuya 25 activación participa el alérgeno mayor PhI p 1 de hierba timotea.

17. Vector de expresión de ADN recombinante que contiene una molécula de ADN según la reivindicación 7 o 8 para el tratamiento de alergias en cuya activación participa el alérgeno mayor PhI p 1 de hierba timotea mediante la vacunación inmunoterapéutica con ADN.

18. Uso del vector de expresión según la reivindicación 17 y/o sus derivados, incluidas sus mezclas en todas

proporciones, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de alergias en cuya activación participa el alérgeno mayor PhI p 1 de hierba timotea mediante vacunación inmunoterapéutica con ADN.

19. Preparación farmacéutica que contiene un vector de expresión según la reivindicación 17 y/o sus derivados farmacéuticamente aplicables, incluidas sus mezclas en todas proporciones, así como, dado el caso, excipientes y/o coadyuvantes, para el tratamiento de alergias en cuya activación participa el alérgeno mayor

PhI p 1 de hierba timotea mediante vacunación inmunoterapéutica con ADN

Figura 1:

SOS·PAGE de nPhl p 1, rPhl p 1·LM Y rPhl p 1·HM

Figura 3: