Variantes de proteínas de fusión de ADP-ribosil transferasa.

El polipéptido con SEQ ID NO: 10.

Variantes de proteínas de fusión de ADP-ribosil transferasa Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud estadounidense n.° 11/643.940 presentada el 22 de diciembre de 2006, que es una continuación en parte de la solicitud estadounidense n.° 10/902.878 presentada el 2 de agosto de 2004 y de la solicitud n.° 10/902.959 presentada el 2 de agosto de 2004, reivindicando ambas solicitudes prioridad de las solicitudes canadienses n.° 2.342.970, 2.362.004 y 2.367.636 presentadas el 12 de abril de 2001, el 13 de noviembre de 2001 y el 15 de enero de 2002 respectivamente, y reivindicando además prioridad de la solicitud provisional estadounidense n.° 60/506.162 presentada el 29 de septiembre de 2003. El contenido total de estas solicitudes, por la presente, se incorpora como referencia.

Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevos antagonistas de la Rho análogos a la C3 quimérica y a su uso para promover la reparación y la supervivencia neuronales en lesiones del sistema nervioso central de mamíferos, incluida la retina, y para la inhibición de la proliferación de células neoplásicas.

Antecedentes La lesión traumática de la médula espinal da como resultado un deterioro funcional permanente. La mayoría de los déficits asociados a la lesión medular resultan de la pérdida de los axones dañados en el sistema nervioso central (SNC) . Análogamente, otras enfermedades del SNC se asocian a pérdida y retracción axonales, como accidentes vasculares cerebrales, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , demencia, enfermedades priónicas, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, lesiones cerebrales traumáticas, degeneración macular y glaucoma. Estas enfermedades del SNC, incluyendo muchas enfermedades oftalmológicas, comparten la pérdida de las conexiones axonales con sus dianas y la muerte celular. La capacidad de estimular el crecimiento de los axones de la población neuronal afectada o dañada mejoraría la recuperación de las funciones neurológicas perdidas y la protección frente a la muerte celular limitaría la extensión del daño. Por ejemplo, después de un accidente vascular en la sustancia blanca, los axones se dañan y se pierden, aun cuando los cuerpos neuronales sigan vivos; el accidente vascular en la sustancia gris destruye muchas neuronas y células no neuronales (gliales) . Los tratamientos eficaces para generar brotes de axones dañados son igualmente efectivos para tratar algunos tipos de accidente vascular cerebral (Chen et al., 2002, PNAS 99:9031-9036) . Con frecuencia se estudian agentes neuroprotectores como posibles compuestos para limitar el daño después del accidente vascular cerebral. Los compuestos con propiedades promotoras del crecimiento y neuroprotectoras son candidatos especialmente buenos para el tratamiento del accidente vascular cerebral y las enfermedades neurodegenerativas.

Se ha propuesto el uso de varios antagonistas de Rho como agentes para estimular la regeneración de axones (seccionados) , es decir, de lesiones nerviosas; véase, por ejemplo, la solicitud de patente canadiense n°. 2.304.981 (McKerracher et al.) y 2.300.878 (Strittmatter) . Estos documentos de solicitud de patente proponen el uso de antagonistas de Rho conocidos, como, por ejemplo, las proteínas C3 quiméricas, así como sustancias seleccionadas entre compuestos trans-4-amino (alquil) -1-piridilcarbamoilciclohexano o inhibidores de la Rho cinasa conocidos para uso en la regeneración de axones. La C3 inactiva la Rho mediante ADP-ribosilación y es poco tóxica para las células (Dillon y Feig, 1995, Methods in Enzymology: Small GTPases and their regulators Part. B, 256: 174-184) .

El tratamiento con antagonistas de la Rho también se usaría para potenciar la velocidad de crecimiento axonal de los nervios periféricos y, por tanto, sería eficaz para la reparación de los nervios periféricos tras la cirugía, por ejemplo, al reimplantar miembros amputados. Además, la Rho es una diana importante para el tratamiento del cáncer y las metástasis (Clark et al., 2000, Nature, 406: 532-535) y la hipertensión arterial (Uehata et al., 1997, Nature, 389: 990) ; se ha descrito que RhoA tiene un efecto cardioprotector (Lee et al., FASEB J., 15: 1886-1884) .

Se ha propuesto la dianización de los mecanismos de señalización intracelular en los que participan Rho y Rho cinasa para promover la regeneración axonal (solicitud de patente canadiense n.° 2.304.981) . La C3 exotransferasa del Clostridium botulinum (a partir de ahora, denominada simplemente C3) puede estimular la regeneración y la gemación de los axones dañados; la C3 es una toxina purificada del Clostridium botulinum (Wilde et al., 2000, J. Biol. Chem., 275: 16478) . Los compuestos de la familia de la C3 del Clostridium botulinum inactivan la Rho por ADPribosilación y, por tanto, actúan como antagonistas del efecto o la función de Rho (antagonistas de Rho) .

Mientras la proteína C3 puede promover eficazmente la regeneración, se ha observado que no penetra fácilmente en las células, por lo que deben administrarse dosis altas para que sea eficaz. La alta dosis de C3 recombinante necesaria para promover la recuperación funcional representa una limitación práctica al uso de C3 in vivo para favorecer la regeneración. En estudios en cultivos tisulares, se ha observado que la cantidad mínima de C3 que puede emplearse para inducir el crecimiento en sustratos inhibidores es de 25 μg/ml (Lehmann et al., 1999, J. Neurosci. 19: 7537-7547) . Si las células no están trituradas, incluso esta dosis es ineficaz. Se ha estimado que se requiere aplicar un mínimo de 40 μg de C3 por 20 g de ratón a la médula espinal o nervio óptico de rata (solicitud de patente canadiense n.° 2.325.842) . Calculando las dosis que serían necesarias para tratar un ser humano adulto con

una dosis equivalente por peso (según la proporción de la dosis empleada en experimentos en ratas y ratones) , se requeriría aplicar 120 mg/kg de C3 a la médula espinal humana dañada. La gran cantidad de proteína C3 recombinante necesaria entraña problemas considerables de fabricación, por la purificación proteica a gran escala y el coste. También limita los intervalos posológicos que pueden analizarse por la gran cantidad de proteína necesaria para las dosis mínimas efectivas.

Otra limitación relacionada respecto al uso de C3 para promover la reparación del SNC dañado es la dificultad de penetración de la membrana plasmática de la célula viva. En estudios en cultivos tisulares en los que se han analizado los efectos biológicos de la C3, esta se ha microinyectado directamente a las células (Ridley y Hall, 1992, Cell, 70: 389-399) o se ha aplicado por trituración de las células para romper la membrana celular (Lehmann et al., 1999, J. Neurosci., 19: 7537-7547) . En la lesión axonal in vivo, la proteína C3 probablemente pueda entrar en las células porque los axones dañados captan ávidamente las sustancias del entorno. Tras la lesión medular (LM) incompleta se observa una plasticidad de los sistemas motores atribuida a niveles cortical y subcortical, incluidos los circuitos medulares. Esta plasticidad puede atribuirse a la gemación axonal o dendrítica de colaterales y al reforzamiento o debilitamiento sinápticos. Además, se ha demostrado que la conservación de algunas fibras ventrolaterales puede traducirse en diferencias significativas de la función motora, dado que estas fibras son importantes para el inicio y el control del patrón locomotor a través de generadores de patrones medulares centrales. Está bien documentado que se produce una reorganización de las fibras medulares corticales colaterales preservadas después de la lesión medular, lo que contribuye a la recuperación funcional. El proceso de reorganización y gemación de las fibras preservadas podría potenciarse con el tratamiento con proteínas similares a la C3 capaces de penetrar en las neuronas no dañadas, lo que fomentaría la plasticidad espontánea de los axones y el remodelado dendrítico que, como es sabido, contribuyen a la recuperación funcional.

Otros métodos de administración de C3 in vitro incluyen la creación de una proteína recombinante que pueda ser captada por un mecanismo mediado por un receptor (Boquet et al., 1995, Meth. Enzymol., 256: 297-306) . El inconveniente de este método estriba en que las células que requieren el tratamiento deben expresar el receptor relevante. Por último, la adición de una proteína de unión C2II al medio de cultivo tisular, junto con una toxina de fusión C21N-C3 permite la captación de C3 por endocitosis mediada por receptor (Barthe et al., 1998, Infection and Immunity, 66: 1364) . El inconveniente de este sistema... [Seguir leyendo]

1. El polipéptido con SEQ ID NO: 10.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, donde dicho polipéptido está PEGilado.

3. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido conforme a una cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 o 2 y un portador farmacéuticamente aceptable.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, donde la composición farmacéutica es estéril Oesterilizable o está esterilizada.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 3 o 4, donde la composición farmacéutica está en un vial en una forma farmacéutica unitaria o en un múltiplo integral de una forma farmacéutica unitaria.

6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde la composición farmacéutica comprende una matriz.

7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, donde la composición farmacéutica está seca o comprende una matriz deshidratada o comprende una proteína de fusión en una matriz liofilizada.

8. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, donde el portador comprende un adhesivo tisular, donde el adhesivo tisular es preferentemente fibrina o un sellador de fibrina, seleccionándose dicho sellador de fibrina opcionalmente del grupo compuesto por Tisseel®, Cebus®, Ateles®, Proleus®, Vivostat®, Cr y oSeaI FS®, CoSeal®, Duraseal®, Poliphase®, Bioglue®, Avitene Flour®, Dermabond®, Hemaseel, Beriplast-P®, Fibrocaps®, Crosseal®, Evicel® y Trombina.

9. Polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para usar en el tratamiento de una lesión de médula espinal en un sujeto que lo necesite.

10. Polipéptido o composición de la reivindicación 9 para usar en el tratamiento de una lesión de médula espinal en un sujeto que lo necesite, donde a) dicho sujeto tiene una enfermedad neurológica o neurodegenerativa, opcionalmente seleccionada del

grupo compuesto por enfermedad de Stargardt, amaurosis congénita de Leber, enfermedad de Best, coroideremia, retinosquisis, síndrome de Bardet-Biedl, neuropatía óptica isquémica anterior, retinopatía de Purtscher, neuritis óptica, edema de disco óptico, enfermedad de Coats y/o aneurisma miliar de Leber, neuropatía inmune y periférica, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, neuropatía axonal gigante,

neuralgia del trigémino, neuralgia glosofaríngea, parálisis de Bell, miastenia grave, distrofia muscular, atrofia muscular progresiva, atrofia muscular bulbar progresiva hereditaria, síndromes por herniación, ruptura o prolapso de discos vertebrales, espondilosis cervical, trastornos del plexo, síndromes de destrucción de la salida torácica, acrilamidas, gamma-dicetonas (neuropatía de adicción al pegamento) , disulfuro de carbono, dapsona, garrapatas, porfiria, síndrome de Gullain-Barré, corea de Huntington,

demencia por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , enfermedades priónicas y glaucoma; o b) dicho sujeto tiene dañado el sistema nervioso como consecuencia de un accidente cerebral vascular, cirugía, infarto, infección, exposición a agentes tóxicos, síndromes de neoplasia maligna o paraneoplásicos, traumatismo o lesión accidental.

11. Polipéptido o composición de la reivindicación 9 para usar en el tratamiento de la lesión de médula espinal en 40 un sujeto que lo necesite, donde dicho sujeto tiene una lesión cerebral traumática.

12. Polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para usar en el tratamiento de la degeneración macular en un sujeto que lo necesite, o para usar en la inhibición o reducción de la tasa de neovascularización sub-retiniana y/o proliferación de tejido neovascular asociado a degeneración macular en el ojo de un sujeto que lo necesite, o para usar en la 45 protección de fotorreceptores retinianos frente a la muerte celular asociada a degeneración macular en el ojo de un sujeto que lo necesite.

13. Polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para usar en la prevención o tratamiento del cáncer, o para usar en la prevención o inhibición de la proliferación no controlada o diseminación o migración de una célula neoplásica metastásica de 50 un cáncer en un sujeto, o para usar en la prevención o inhibición de la proliferación no controlada o diseminación o migración, dentro de un margen de resección de un tejido hospedador proximal al lugar de extirpación de un tumor de un cáncer en un sujeto, de una célula neoplásica metastásica que reside en el margen de resección, donde el polipéptido o la composición está adaptado opcionalmente para administrar directamente en la superficie del margen de resección o por debajo de la superficie del margen de resección o

dentro del tejido proximal al margen de resección que permanece en el sujeto; donde el cáncer es seleccionado del grupo compuesto por cáncer de mama, cerebral, de colon, de piel, renal y hepático.

14. Polipéptido o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para usar en el tratamiento de una lesión de médula espinal en un sujeto que lo necesite, donde el polipéptido o la composición está adaptado 5 para administración mediante inyección, aplicación tópica o implantación.

15. Polipéptido o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para usar en el tratamiento de una lesión de médula espinal en un sujeto que lo necesite, donde el sujeto es un mamífero, preferentemente un ser humano.

16. Polipéptido o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 para usar en el tratamiento de una 10 lesión de médula espinal en un sujeto que lo necesite, donde se fomenta el crecimiento o regeneración axonal

o neurítica, o se inhibe la angiogénesis, en dicho sujeto.

17. Polipéptido conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para usar como un medicamento.