Variante de lipasa.

Lipasa que es un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que:

a) tiene al menos 95 % identidad con la lipasa tipo salvaje derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109;

b) en comparacion con dicha lipasa tipo salvaje, comprende una sustitucion de T231 R +N233R; y

I) comprende una adicion peptidica al C-terminal; y/o

II) presenta las siguientes limitaciones:

i) comprende un aminoacido negativo en la posicion E210 de dicha lipasa tipo salvaje;

ii) comprende un aminoacido cargado negativamente en la region correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasade tipo salvaje; y

iii) comprende un aminoacido neutro o negativo en una posicion correspondiente a N94 de dicha lipasa tipo salvaje y/o tieneuna carga electrica neta neutra o negativa en la region correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasa tipo salvaje.

Variante de lipasa

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a variantes de lipasa adecuadas para uso en composiciones detergentes. Más particularmente, la invención se refiere a variantes de la lipasa tipo salvaje de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109 que muestra un efecto de primer lavado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Durante varios años, las lipasas han sido usadas como enzimas de detergente para eliminar manchas de lípidos o grasas de ropa y otros tejidos, particularmente una lipasa derivada de Humicola lanuginosa (EP 258 068 y EP 305 216)

vendida bajo el nombre comercial Lipolase® (producto de Novo Nordisk A/S) .

WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202 revelan variantes de la lipasa de H. lanuginosa con propiedades mejoradas para uso detergente. Así, WO 97/04079 divulga variantes con una adición peptídica (extensión) en el N-terminal y/o el C-terminal. WO 97/07202 divulga variantes de lipasa con "rendimiento de primer lavado"

que son capaces de eliminar cantidades sustanciales de manteca de cerdo de una muestra manchada de manteca de cerdo en un ciclo de lavado.

Hay siempre una necesidad existente de suministrar lipasas nuevas con propiedades de lavado en una variedad de detergentes comerciales. La presente invención se refiere a tales lipasas nuevas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han encontrado que determinadas variantes de Lipolasa (lipasa de tipo salvaje de Humicola lanuginosa) tienen un rendimiento de primer lavado particularmente bueno en una solución de detergente. Las lipasas pueden proporcionar además beneficios adicionales, tales como mantenimiento de blancura y limpieza de suciedad.

Los inventores encontraron que las variantes deberían comprender una o más sustituciones con aminoácidos positivos cerca del N-terminal en la estructura tridimensional. Las variantes deberían comprender además una adición peptídica al C- terminal y/o deberían encontrar ciertas limitaciones en aminoácidos eléctricamente cargados en posiciones 90-101 y 210.

Por consiguiente, la invención proporciona una lipasa que es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que:

(a) tiene al menos un 95% de identidad con la lipasa tipo salvaje derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109 y

(b) en comparación con dicha lipasa tipo salvaje, comprende una sustitución de T231R+N233R; y (I) comprende una adición

peptídica al C-terminal; y/o (II) presenta las siguientes limitaciones: (i) comprende un aminoácido negativo en la posición E210 de dicha lipasa de tipo salvaje; (ii) comprende un aminoácido negativamente cargado en la región correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasa de tipo salvaje; y (iii) comprende un aminoácido negativo o neutro en una posición correspondiente a N94 de dicha lipasa tipo salvaje y/o tiene una carga eléctrica neta neutra o negativa en la región correspondiente a las posiciones 90-101 de dicha lipasa de tipo salvaje.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Lipasa Humicola lanuginosa 50 [0008] La lipasa de referencia usada en esta invención es la lipasa tipo salvaje derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109. Está descrito en los documentos EP 258 068 y EP 305 216 y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las posiciones 1-269 de SEC ID n.º: 2 de US 5, 869, 438. En esta especificación, la lipasa de referencia es también denominada Lipolasa.

Sustitución con aminoácido positivo [0009] La lipasa de la invención comprende uno o más (p. ej. 2-4, particularmente dos) sustituciones de un aminoácido cargado negativamente o eléctricamente neutro cerca de E1 o Q249 con un aminoácido positivamente cargado, preferiblemente R.

La sustitución está en la superficie de la estructura tridimensional dentro de 15 A de E1 o Q249, por ejemplo en

cualquiera de las posiciones 1-11, 90, 95, 169, 171-175, 192-211, 213-226, 228-258, 260-262.

La sustitución puede estar dentro de 10 A de E1 o Q249, por ejemplo en cualquiera de las posiciones 1-7, 10, 175, 195, 197-202, 204- 206, 209, 215, 219-224, 230-239, 242-254. [0012] La sustitución puede estar dentro de 15 A de E1, por ejemplo en cualquiera de las posiciones 1-11, 169, 171, 192

199, 217-225, 228- 240, 243-247, 249, 261-262.

La sustitución está más preferiblemente dentro de 10 A de E1, por ejemplo en cualquiera de las posiciones 1-7, 10, 219-224 y 230-239. [0014] Así, algunas sustituciones preferidas son S3R, S224R, P229R, T231 R, N233R, D234R y T244R.

Adición peptídica a C-terminal

La lipasa puede comprender una adición peptídica fijada a C-terminal L269. La adición peptídica mejora el rendimiento de primer lavado en una variedad de detergentes.

La adición peptídica preferiblemente consiste en 1-5 aminoácidos, por ejemplo 2, 3 o 4 aminoácidos. Los aminoácidos de la adición peptídica serán numerados 270, 271, etc.

La adición peptídica puede consistir en aminoácidos eléctricamente neutros (p. ej. hidrófobos) , por ejemplo PGL o PG. En una forma de realización alternativa, la adición de péptido de lipasa consiste en aminoácidos neutros (p. ej. hidrófobos) y el aminoácido C, y la lipasa comprende sustitución de un aminoácido con C en una ubicación adecuada para formar un puente disulfuro con el C de la adición peptídica. Ejemplos son:

270C enlazado a G23C o T37C

271 C enlazado a K24C, T37C, N26C o R81 C

272C enlazado a D27C, T35C, E56C, T64C o R81C.

Aminoácidos en posiciones 90-101 y 210

La lipasa de la invención preferiblemente presenta ciertas limitaciones en aminoácidos eléctricamente cargados en posiciones 90-101 y 210. Las lipasas que presentan limitaciones de carga son particularmente eficaces en un detergente con alto contenido de aniónico.

Así, el aminoácido 210 puede ser negativo. E210 puede estar invariado o puede tener la sustitución E210D/C/Y, particularmente E210D.

La lipasa puede comprender un aminoácido cargado negativamente en cualquiera de las posiciones 90-101 (particularmente 94-101) , por ejemplo en la posición D96 y/o E99.

Además, la lipasa puede comprender un aminoácido neutro o negativo en la posición N94, es decir N94 (neutro o negativo) , por ejemplo N94N/D/E.

También, la lipasa puede tener una carga eléctrica neta neutra o negativa en la región 90-101 (particularmente 94101) , es decir el número de aminoácidos negativos es igual o mayor al número de aminoácidos positivos. Así, la región puede estar invariada de la Lipolasa, que tiene dos aminoácidos negativos (D96 y E99) y un positivo (K98) , y con un aminoácido neutro en la posición 94 (N94) , o la región se puede modificar por una o más sustituciones.

Alternativamente, dos de los tres aminoácidos N94, N96 y E99 pueden tener una carga eléctrica negativa o invariada. Así, los tres aminoácidos pueden ser invariados o se pueden cambiar por una sustitución conservadora o negativa, es decir N94 (neutro o negativo) , D (negativo) y E99 (negativo) . Ejemplos son N94D/E y D96E. También, uno de los tres se puede sustituir para aumentar la carga eléctrica, es decir N94 (positivo) , D96 (neutro o positivo) o E99 (positivo o neutro) . Ejemplos son N94K/R, D96I/L/N/S/W o E99N/Q/K/R/H.

La sustitución de un aminoácido neutro con uno negativo (N94D/E) , puede mejorar el rendimiento en un detergente aniónico. La sustitución de un aminoácido neutro con un aminoácido positivo (N94K/R) puede proporcionar una lipasa variante con buen rendimiento tanto en un detergente aniónico como en un detergente aniónico/no iónico (un detergente con

por ejemplo 40-70 % aniónico respecto al surfactante total) .

Aminoácidos en otras posiciones [0025] Los inventores han encontrado que una sustitución Q249R/K/H puede mejorar el rendimiento tanto en un detergente aniónico como en aniónico/no iónico, y que una sustitución de R209 con un aminoácido neutro o negativo (p. ej. R209P/S) puede mejorar el rendimiento en el detergente aniónico. La lipasa puede opcionalmente comprender la sustitución G91A.

La lipasa puede opcionalmente comprender sustituciones de uno o más aminoácidos adicionales. Tales sustituciones 10 pueden, por ejemplo, ser hechas según principios conocidos en la técnica, por ejemplo sustituciones descritas en WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202.

Combinaciones de sustituciones [0027] Una variante de lipasa con buen rendimiento de primer lavado se puede obtener modificando la Lipolasa de la siguiente manera. Las sustituciones entre paréntesis son opcionales.

T231R+ N233R

N94K+... [Seguir leyendo]

1. Lipasa que es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que:

a) tiene al menos 95 % identidad con la lipasa tipo salvaje derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109; b) en comparación con dicha lipasa tipo salvaje, comprende una sustitución de T231 R +N233R; y

I) comprende una adición peptídica al C-terminal; y/o II) presenta las siguientes limitaciones:

i) comprende un aminoácido negativo en la posición E210 de dicha lipasa tipo salvaje; ii) comprende un aminoácido cargado negativamente en la región correspondiente a las posicione.

9. 101 de dicha lipasa de tipo salvaje; y iii) comprende un aminoácido neutro o negativo en una posición correspondiente a N94 de dicha lipasa tipo salvaje y/o tiene una carga eléctrica neta neutra o negativa en la región correspondiente a las posicione.

9. 101 de dicha lipasa tipo salvaje.

2. Lipasa de la reivindicación precedente que comprende 2-4 (preferiblemente dos) de dichas sustituciones.

3. Lipasa según cualquier reivindicación precedente que comprende aminoácidos con carga eléctrica invariada o negativa en al menos dos de las posiciones N94, D96 y E99 de dicha lipasa tipo salvaje.

4. Lipasa de cualquier reivindicación precedente que comprende una sustitución G91A, N94D/E/K/R, D96E/I/L/N/S/W, E99N/Q/K/R/H o N101S.

5. Lipasa de cualquier reivindicación precedente que comprende las sustituciones D96 (positivo o neutro) +Q249R/K/H, opcionalmente combinados con R209 (negativo o neutro) .

6. Lipasa de cualquier reivindicación precedente con una secuencia de aminoácidos que se obtiene modificando la lipasa tipo salvaje derivada de la cepa de Humicola lanuginosa DSM 4109 de la siguiente manera:

a) T231 R +N233R, b) R209P +T231 R +N233R, c) N33Q +D96S +T231R +N233R +Q249R o d) E99N +N101S +T231R +N233R +Q249R.

7. Lipasa según la reivindicación 1 donde los aminoácidos en posicione.

9. 101 y 210 son invariados.

8. Composición de detergente que comprende un surfactante y la lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Composición de detergente de la reivindicación precedente donde el surfactante comprende surfactante aniónico en una cantidad superior a 70 % en peso del surfactante total.

10. Secuencia de ADN que codifica la lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

11. Vector de expresión que contiene la secuencia de ADN de la reivindicación precedente.

12. Célula huésped transformada que contiene la secuencia de ADN según la reivindicación 10 o el vector de expresión según la reivindicación 11.

13. Método para producir la lipasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el cual método comprende el cultivo de la célula huésped transformada según la reivindicación 12 bajo condiciones que permitan la producción de la lipasa y la recuperación de la lipasa del caldo resultante.