Vacuna que comprende proteína NMB0964 de Neisseria meningitidis.

Una composición inmunogénica que comprende: vesículas de membrana externa aislada preparadas a partir de unaespecie de bacteria de Neisseria,

en donde la especie de bacteria Neisseria produce un nivel de un polipéptidoNMB0964, el cual en la cepa MC58 de N. meningitidis tiene la secuencia mostrada en la figura S1, suficiente paraproducir una vesícula la cual, cuando se administra a un sujeto, genera anticuerpos anti-NMB0964; y un excipientefarmacéuticamente aceptable, en donde

(i) dicha especie de bacteria de Neisseria se modifica genéticamente a través de la interrupción de la expresiónfuncional del represor Zur (NMB1266); y/o

(ii) dicha especie de bacteria de Neisseria se cultiva en un medio que tiene menos de 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7,0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,05 o 0,01 μM de Zn2+ libre; o

(iii) la especie de bacteria de Neisseria se cultiva en un medio que comprende un quelante de Zn2+.

Vacuna que comprende proteína NMB0964 de Neisseria meningitidis Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas para la prevención de enfermedades originadas por la bacteria Neisseria, en particular Neisseria meningitidis.

Antecedentes de la Invención Las cepas de la bacteria Neisseria son agentes que causan una cantidad de patologías en humanos, contra las cuales existe la necesidad de que se desarrollen vacunas efectivas. En particular, Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis originan patologías que pueden ser tratadas mediante vacunación.

Neisseria gonorrhoeae es el agente etiológico de gonorrea, una de las enfermedades de transmisión sexual de las que se informa con mayor frecuencia en el mundo, con una incidencia anual estimada de 62 millones de casos (Gerbase y col 1998 Lancet 351; (Supl 3) 2-4) . Las manifestaciones clínicas de gonorrea incluyen inflamación de las membranas mucosas del tracto urogenital, garganta o recto e infecciones en ojos de neonatos. Las infecciones gonocócicas en incremento en mujeres, pueden conducir a infertilidad, embarazo ectópico, enfermedad inflamatoria pélvica crónica y formación de abscesos tubo-ováricos. La septicemia, artritis, endocarditis y meningitis están asociadas con gonorrea complicada.

El alto número de cepas gonocócicas con resistencia a antibióticos, contribuye a una morbilidad incrementada y a complicaciones asociadas con gonorrea. Una alternativa atractiva de tratamiento de gonorrea con antibióticos, puede ser su prevención usando vacunación. Actualmente no existe una vacuna para infecciones de N. gonorrhoeae.

Neisseria meningitidis es un patógeno importante, particularmente en niños y adultos jóvenes. La septicemia y meningitis son las formas de enfermedad meningocócica invasiva (IMD) , que implican un mayor riesgo de perder la vida. Esta enfermedad se ha vuelto un problema de salud a nivel mundial debido a su alta morbilidad y mortalidad.

Se han identificado 30 serogrupos de N. meningitidis con base en diferencias antigénicas en los polisacáridos capsulares, siendo los más comunes A, B y C que son responsables del 90 % de la enfermedad a nivel mundial. El serogrupo B, es la causa más común de enfermedad meningocócica en Europa, E.U.A. y diversos países de Latinoamérica.

Las vacunas basadas en el polisacárido capsular de los serogrupos A, C, W y Y, han sido desarrolladas y han demostrado controlar los desencadenamientos de enfermedad meningocócica (Peltola y col. 1985 Pediatrics 76; 91-96) . Sin embargo el serogrupo B es débilmente inmunogénico e induce únicamente a una respuesta de anticuerpo temporal de un isotipo predominantemente IgM (Ala'Aldeen D y Cartwright K 1996, J. Infect. 33; 153-157) . Por consiguiente, no existe actualmente disponible una vacuna ampliamente efectiva contra meningococo del serogrupo B, el cual es el responsable de la mayoría de las enfermedades en la mayoría de los países templados. Esto es particularmente problemático, ya que la incidencia de la enfermedad de serotipo B está aumentando en Europa, Australia y América, en su mayoría en niños menores de 5 años. El desarrollo de una vacuna contra meningococo del serogrupo B, presenta dificultades particulares debido a que la cápsula de polisacárido es débilmente inmunogénica debido a su similitud inmunológica con la molécula de adhesión de célula neural humana. Las estrategias para producción de vacunas, han estado concentradas por lo tanto en las estructuras expuestas a la superficie de la membrana externa meningocócica, pero han sido obstaculizadas por variaciones marcadas en estos antígenos entre las cepas. El documento WO01/65772 y base de datos Geneseq, 12 de marzo de 2002, nº de referencia AAU73011 desvelan una “proteína de virulencia de Neisseria meningitidis nº 101”. Vaughan y col. 2006, Vaccine 24:5277-5293 desvelan antígenos de vacuna de vesícula de membrana externa de Neisseria lactamica y meningitidis.

Otros avances han conducido a la introducción de vacunas elaboradas de vesículas de membrana externa que contendrán varias proteínas que constituyen el contenido normal de la membrana bacteriana. Una de estas es la vacuna Cubana VA-MENGOC-BC contra serogrupos B y C N. meningitidis (Rodriguez y col. 1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440) . Esta vacuna fue diseñada para combatir un desencadenamiento invasivo de enfermedad meningocócica en Cuba, el cual no había sido eliminado mediante un programa de vacunación usando una vacuna de polisacárido capsular AC. Los serogrupos prevalecientes fueron B y C y la vacuna VA-MENGOC-BC® tuvo éxito en controlar el desencadenamiento con una eficiencia de vacuna estimada del 83 % contra las cepas del serogrupo B de N. meningitidis (Sierra y col. 1990 en Neisseria, Walter Gruyter, Berlin, M. Achtman y col. (eds) p 129-134, Sierra y col. 1991, NIPH Ann 14; 195-210) . Esta vacuna fue efectiva contra un desencadenamiento específico, sin embargo la respuesta inmune provocada, no puede proteger contra otras cepas de N. meningitidis.

Los estudios de eficacia subsecuentes conducidos en Latinoamérica durante epidemias, originadas por cepas meningocócicas de serogrupo B homólogas y heterólogas, han mostrado algo de eficacia en niños de más edad y en adultos, pero su efectividad fue significativamente menor en niños pequeños, quienes están en mayor riesgo de infección (Milagres y col. 1994, Infect. Immun. 62; 4419-4424) . Es cuestionable cuán efectiva puede ser una vacuna en países con enfermedad endémica de multicepa, tales como Reino Unido. Los estudios de inmunogenicidad contra cepas heterólogas han demostrado únicamente actividad bactericida de suero de reacción cruzada limitada, especialmente en infantes (Tappero y col. 1999, JAMA 281; 1520-1527) .

En Noruega se desarrolló una segunda vacuna de vesícula de membrana externa, usando un aislado de serotipo B típico de los prevalecientes en Escandinavia (Fredriksen y col. 1991, NIPH Ann, 14; 67-80) . Esta vacuna se probó en pruebas clínicas y se encontró que tiene eficacia protectora del 57 %, después de 29 meses (Bjune y col. 1991, Lancet, 338; 1093-1096) .

Existen diversos problemas con las vacunas anti-meningocócicas actualmente disponibles. Las vacunas de membrana externa a base de proteína tienden a ser específicas y efectivas únicamente contra algunas cepas. Las vacunas de polisacárido también son sub-óptimas, ya que tienden a provocar respuestas inmunes deficientes y cortas, particularmente contra el serogrupo B (Lepow y col. 1986, J. Infect. Dis. 154:1033-1036; Peltola 1985, Pediatrics 76; 9196) .

Las infecciones de Neisseria representan un problema de salud considerable para el cual no hay disponibles vacunas en el caso de N. gonorrhoeae o hay disponibles vacunas con limitaciones en su eficacia y capacidad de proteger contra cepas heterólogas, en el caso de N. meningitidis. Existe claramente la necesidad de desarrollar vacunas superiores contra infecciones de Neisseria, que mejorarán la eficacia de vacunas normalmente disponibles y permitirán la protección contra un mayor rango de cepas.

Sumario de la Invención Los inventores de la presente invención, han encontrado que el antígeno de Neisseria NMB0964 (los números de NMB se refieren a las secuencias del genoma de Neisseria meningitidis del grupo B disponibles en www.neisseria.org) [conocido como NMA1161 en el genoma del grupo A de Neisseria meningitidis de la cepa Z2491, y BASB082 en la Publicación Internacional WO 00/55327, y como ZnuD] es un antígeno conservado en Neisseria y puede inducir anticuerpos bactericidas contra un rango de cepas de Neisseria. Los inventores de la presente invención han descubierto que este antígeno funciona como un receptor Zn2+ en la bacteria, y su expresión es regulada por el nivel de Zn2+ en el medio.

La presente invención proporciona de manera general procedimientos y composiciones para generar una respuesta inmune contra la especie de bacteria de Neisseria spp. en un sujeto, particularmente contra la cepa de Neisseria meningitidis del serogrupo B.

En un aspecto la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende: vesículas de membrana externa aisladas preparadas de una especie de bacteria de Neisseria, en donde la especie de bacteria de Neisseria produce un nivel de polipéptido NMB0964 suficiente para producir de una vesícula que, cuando se administra a un sujeto, genera anticuerpos anti-NMB0964; y un excipiente farmacéuticamente, en el que

(i) dicha especie de bacteria de Neisseria está modificada genéticamente a través de la interrupción de la expresión funcional del represor Zur (NMB1266) ; y/o

(ii) dicha especie de bacteria de Neisseria se cultiva... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica que comprende: vesículas de membrana externa aislada preparadas a partir de una especie de bacteria de Neisseria, en donde la especie de bacteria Neisseria produce un nivel de un polipéptido NMB0964, el cual en la cepa MC58 de N. meningitidis tiene la secuencia mostrada en la figura S1, suficiente para producir una vesícula la cual, cuando se administra a un sujeto, genera anticuerpos anti-NMB0964; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde

(i) dicha especie de bacteria de Neisseria se modifica genéticamente a través de la interrupción de la expresión funcional del represor Zur (NMB1266) ; y/o

(ii) dicha especie de bacteria de Neisseria se cultiva en un medio que tiene menos de 5, 4, 3, 2, 1, 0, 9, 0, 8, 0, 7, 0, 6, 0, 5, 0, 4, 0, 3, 0, 2, 0, 1, 0, 05 o 0, 01 !M de Zn2+ libre; o

(iii) la especie de bacteria de Neisseria se cultiva en un medio que comprende un quelante de Zn2+.

2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que el nivel del polipéptido NMB0964 producido a través de la especie de bacteria de Neisseria es:

mayor que el elaborado a través de la cepa H44/76 de N. meningitidis desarrollada en un caldo de soja tríptico (TSB) , o; es igual o mayor que el elaborado por la cepa H44/76 de N. meningitidis desarrollada en un medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) , o; es igual o mayor que el elaborado por la cepa H44/76 de N. meningitidis desarrollada en un medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) con 1 μM de TPEN (N, N, N’, N’-Tetrakis (2-piridilmetil) etilendiamina) , o; es igual o mayor que el elaborado por la cepa H44/76 de N. meningitidis en un medio el cual tiene menos de 5, 4, 3, 2, 1, 0, 9, 0, 8, 0, 7, 0, 6, 0, 5, 0, 4, 0, 3, 0, 2, 0, 1, 0, 05 o 0, 01 μM de Zn2+ libre.

3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 o 2, en la que la especie de bacteria de Neisseria es Neisseria meningitidis o Neisseria meningitidis serogrupo B.

4. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-3, en la que la especie de bacteria de Neisseria tiene deficiencia del polisacárido capsular, preferentemente en la que la especie de bacteria de Neisseria tiene deficiencia del polisacárido capsular a través de la interrupción de la expresión funcional del gen siaD.

5. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la especie de bacteria de Neisseria es interrumpida en:

la expresión funcional de los genes msbB y/o htrB; y/o la expresión de uno o más de los siguientes genes: PorA, PorB, OpA, OpC, PilC o FrpB; y/o la expresión funcional del gen lgtB.

6. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-5, en la que la especie de bacteria de Neisseria es del inmunotipo L2 o L3.

7. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-6, en la que las vesículas de membrana externa son aisladas extrayendo con el 0-0, 5, 0, 02-0, 4, 0, 04-0, 3, 0, 06-0, 2 o 0, 08-0, 15 % de detergente, por ejemplo desoxicolato, por ejemplo con aproximada o exactamente el 0, 1 % de desoxicolato.

8. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que el quelante de Zn2+ está presente en el medio en una concentración de 0, 01-100, 0, 1-10, 0, 3-5 o 0, 5-1 μM.

9. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 u 8, en la que el quelante de Zn2+ presente en el medio es TPEN.

10. Un procedimiento para producir una composición inmunogénica, comprendiendo el procedimiento:

cultivar una especie de bacteria de Neisseria que produce un polipéptido NMB0964, el cual en la cepa MC58 de N. meningitidis tiene la secuencia mostrada en la figura S1, en donde el polipéptido NMB0964 es producido a un nivel suficiente para producir vesículas de membrana externa que, cuando se administran a un sujeto, generan anticuerpos anti-NMB0964; preparar vesículas de membrana externa a partir de la bacteria cultivada; y combinar las vesículas de la membrana externa con un excipiente farmacéuticamente aceptable para producir una composición inmunogénica adecuada para administración a un sujeto, en donde

(i) dicha especie de bacteria de Neisseria ha sido modificada genéticamente a través de la interrupción de la expresión funcional del represor Zur (NMB1266) ; y/o

(ii) dicho cultivo de la especie de bacteria de Neisseria está en un medio que tiene menos de 5, 4, 3, 2, 1, 0, 9, 0, 8, 0, 7, 0, 6, 0, 5, 0, 4, 0, 3, 0, 2, 0, 1, 0, 05 o 0, 01 μM de Zn2+ libre; o

(iii) dicho cultivo de la especie de bacteria de Neisseria está en un medio que comprende un quelante de Zn2+

.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que:

el nivel de polipéptido NMB0964 producido por la especie de bacteria de Neisseria es como se ha definido en la reivindicación 2; la especie de bacteria de Neisseria es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 3-6; y/o la etapa de preparar vesículas de membrana externa se lleva a cabo como se ha definido en la reivindicación 7, o se lleva a cabo sin el uso de un detergente.

12. El procedimiento de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que el quelante de Zn2+ está presente en el medio en una concentración de 0, 01-100, 0, 1-10, 0, 3-5 o 0, 5-1 μM.

13. El procedimiento de las reivindicaciones 10-12, en el que el quelante de Zn2+ presente en el medio es TPEN.

14. Una composición inmunogénica que se puede obtener por medio del procedimiento de la reivindicación 10.

15. Un uso de la composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-9 en la fabricación de una vacuna para la prevención de una enfermedad causada por Neisseria; o una vacuna para su uso en la prevención de una enfermedad causada por Neisseria, por ejemplo, N. meningitidis o N. meningitidis serogrupo B, que comprende la composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-9, o elaborada por medio del procedimiento de las reivindicaciones 10.13.