Vacuna de peptidasa C5a estreptococal.

Una vacuna que comprende una cantidad inmunogénica de un péptido aislado y purificado que comprendeuna Peptidasa C5a Estreptococal (SCP) enzimáticamente inactiva,

cuya cantidad es eficaz para inmunizar a unmamífero susceptible frente a Estreptococos ß-hemolíticos en combinación con un vehículo no tóxico fisiológicamenteaceptable, en don de la SCP es una variante de SCP natural en la que la SCP variante presenta al menos

(i) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminiácido 193 de la SEQ ID NO: 1 yopcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a losaminoácidos 130, 260, 261, 262, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(ii) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 130 de la SEQ ID NO: 1 yopcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a losaminoácidos 193, 260, 261, 262, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(iii) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 260 de la SEQ ID NO: 1 yopcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a losaminoácidos 130, 193, 261, 262, 295, 415, 416,417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(iv) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 261 de la SEQ ID NO: 1 yopcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a losaminoácidos 130, 193, 260, 262, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(v) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 262 de la SEQ ID NO: 1 yopcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a losaminoácidos 130, 193, 260, 261, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(vi) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 415 de la SEQ ID NO: 1 yopcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a losaminoácidos 130, 193, 260, 261, 262, 295, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(vii) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 416 de la SEQ ID NO: 1 yopcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a losaminoácidos 130, 193, 260, 261, 262, 295, 415, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1, o

(viii) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 417 de la SEQ ID NO: 1 yopcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a losaminoácidos 130, 193, 260, 261, 262, 295, 415, 416, o 512 de la SEQ ID NO:1.

Vacuna de peptidasa C5a estreptococal

Antecedentes de la Invención Existen varias especies estreptococales º-hemolíticas diferentes que han sido identificadas. El Streptococcus pyogenes, también denominado estreptococo de grupo A, es un patógeno bacteriano común en humanos. Principalmente una enfermedad de niños, provoca una variedad de infecciones que incluyen faringitis, impétigo y sepsis en humanos. Este patógeno también causa enfermedades agudas severas tales como la fiebre escarlata, la fascitis necrotizante y el choque tóxico.

El dolor de garganta provocado por estreptococos de grupo A, denominado comúnmente “amigdalitis”, es el responsable de al menos el 16% de todas las llamadas oficiales en la práctica de la medicina general, dependiendo de la época del año. Hope-Simpson, E., “Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 19621975”, J. Hyg. Camb., 87: 109-129 (1981) . Esta especie también es la causa del reciente resurgimiento en Norte América y otros cuatro continentes de choques tóxicos asociados a la fascitis necrotizante. Stevens, D. L., “Invasive group A streptococcus infections”, Clin. Infect. Dis., 14: 2-13 (1992) . Los grupos C y G de estreptococos también están implicados en la generación de dolor de garganta y, ocasionalmente, de choque tóxico. Hope-Simpson, E., “Streptococcus pyogenes in the throat: A study in a small population, 1962-1975”, J. Hyg. Camb., 87: 109-129 (1981) .

Los estreptococos de grupo B, también conocidos como Streptococcus agalactiae, son responsables de la sepsis neonatal y de la meningitis. T. R. Martin y col., “The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats”, J. Infect. Dis., 165: 306-314 (1992) . Aunque frecuentemente es un miembro de la flora de la mucosa vaginal de las hembras adultas, entre 0, 1 y 0, 5/1000 recién nacidos desarrollan una enfermedad grave después de una infección durante el parto. A pesar de la elevada mortalidad de las infecciones de estreptococos de grupo B, los mecanismos de patogenicidad son poco comprendidos. Martin, T. R., y col., “The effect of type-specific polysaccharide capsule on the clearance of group B streptococci from the lung of infant and adult rats”, J. Infect. Dis., 165: 306-314 (1992) .

Las infecciones estreptococales se tratan actualmente mediante terapia con antibióticos. Sin embargo, el 25-30% de los tratados presentan recurrencia de la enfermedad y/o se mudan del organismo en secreciones de mucosa. Actualmente no existe disponible ningún modo de prevenir las infecciones estreptococales. Históricamente, el desarrollo de una vacuna estreptococal se ha centrado en la proteína M de la superficie celular de la bacteria. Bessen, D., y col., “Influence of intranasal immunization with synthetic peptides corresponding to conserved epitopes of M protein on mucosal colonization by group A streptococci”, Infect. Immun., 56: 2666-2672 (1988) ; Bronze, M. S., y col., “Protective immunity evoked by locally administered group A streptococcal vaccines in mice”, Journal of Immunology, 141: 2767-2770 (1988) .

Dos problemas principales limitarán el uso, la comercialización y, posiblemente, la aprobación de la FDA, de una vacuna de proteína M. En primer lugar, existen más de 80 serotipos diferentes de M de S. pyogenes y continuamente aparecen nuevos serotipos. Fischetti, V. A., “Streptococcal M protein: molecular design and biological behavior, Clin. Microbiol. Rev., 2: 285-314 (1989) . Por tanto, la inoculación con una proteína M específica de un serotipo probablemente no será eficaz en la protección frente a otros serotipos de M. El segundo problema está relacionado con la seguridad de una vacuna de proteína M. Varias regiones de la proteína M contienen epítopos antigénicos que son inmunológicamente reactivos con tejidos humanos, particularmente con tejido cardiaco. Los extremos N de las proteínas M son altamente variables en su secuencia y en su especificidad antigénica. Se necesitaría la inclusión de más de 80 péptidos diferentes, que representan dicha secuencia variable, en una vacuna para lograr una amplia protección contra la infección por estreptococos de grupo A. Seguirían apareciendo nuevas proteínas M variantes, lo que requeriría un control continuo de la enfermedad estreptococal y cambios en la composición de la vacuna. Por el contrario, los extremos carboxilo de las proteínas M tienen una secuencia conservada. Esta región de la proteína M, sin embargo, contiene una secuencia de aminoácidos que es inmunológicamente reactiva con el tejido cardiaco humano. Se cree que esta propiedad de la proteína M es responsable del daño de válvula cardiaca asociado a la fiebre reumática. P. Fenderson y col., “Tropomyosinsharies immunologic epitopes with group A streptococcal M proteins”, J. Immunol. 142: 2475-2481 (1989) . En un ensayo anterior, niños que habían sido vacunados con proteína M en 1979 tuvieron una incidencia diez veces mayor de fiebre reumática y del daño de válvula cardiaca asociado. Massell, B. F., y col., “Rheumatic fever following streptococcal vaccination”, JAMA, 207: 1115-1119 (1969) .

Otras proteínas bajo consideración para el desarrollo de una vacuna son las toxinas eritrogénicas, la exotoxina A pirogénica estreptococal y la exotoxina B pirogénica estreptococal. Lee, P. K., y col., “Quantification and toxicity of group A streptococcal pyrogenic exotoxins in an animal model of toxic shock syndrome-like illness”, J. Clin. Microb.,

27: 1890-1892 (1989) . La inmunidad a estas proteínas podría prevenir los síntomas mortales del choque tóxico, pero puede que no prevenga la colonización mediante estreptococos.

El documento WO 97/26008 describe vacunas para su uso frente a colonización de Estreptococos º-hemolíticos que comprende peptidasa C5a estreptococal o fragmentos o mutantes de la misma. Stafslien y Clear y (Abstracts of the General Meeting of the American Society for Microbiology, 1998, Vol. 98, página 59) describen que se usó el método de megacebador de mutagénesis dirigida a posición para introducir una mutación en el gen scpA49 que cambió el supuesto centro activo de serina de la proteasa por una alanina. Esta mutación no afectó a la capacidad de la proteína para unirse a anticuerpo policlonal, según se observó mediante transferencia Western y ELISA competitivo. Sin embargo, la mutación eliminó la capacidad de la enzima para romper C5a in vitro, según se determinó usando un ensayo de adherencia PMN.

Por tanto, sigue existiendo una necesidad de obtener un medio eficaz de prevenir o paliar las infecciones estreptococales. Más específicamente, existe una necesidad de desarrollar composiciones útiles en vacunas para prevenir o paliar la colonización por estreptococos de tejidos hospedantes, reduciendo con ello la incidencia de la amigdalitis y del impétigo. La eliminación de secuelas tales como la fiebre reumática, la glomerulonefritis aguda, la sepsis, el choque tóxico y la fascitis necrotizante sería una consecuencia directa de la reducción de la incidencia de la infección aguda y del transporte en el organismo. También existe la necesidad de desarrollar composiciones útiles en vacunas para prevenir o paliar infecciones causadas por las especies estreptococales º-hemolíticas, a saber, los grupos A, B, C y G.

Resumen de la Invención La presente invención proporciona una vacuna, y métodos de vacunación, eficaces para inmunizar a un mamífero susceptible frente a Streptococcus º-hemolíticos. El mamífero susceptible podría ser un humano o un animal doméstico tal como un perro, una vaca, un cerdo o un caballo. Dicha inmunización prevendría, paliaría o reduciría la incidencia de la colonización de Streptococcus º-hemolíticos en el mamífero. La vacuna comprende una cantidad inmunogénica de un péptido aislado y purificado que comprende una Peptidasa C5a Estreptococal (SCP) enzimáticamente inactiva, cuya cantidad es eficaz para inmunizar a un mamífero susceptible frente a Streptococcus º-hemolíticos en combinación con un vehículo no tóxico fisiológicamente aceptable, en donde la SCP es una variante de la SCP natural que presenta al menos (i) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminiácido 193 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos 130, 260, 261, 262, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(ii) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 130 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna que comprende una cantidad inmunogénica de un péptido aislado y purificado que comprende una Peptidasa C5a Estreptococal (SCP) enzimáticamente inactiva, cuya cantidad es eficaz para inmunizar a un mamífero susceptible frente a Estreptococos º-hemolíticos en combinación con un vehículo no tóxico fisiológicamente aceptable, en donde la SCP es una variante de SCP natural en la que la SCP variante presenta al menos

(i) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminiácido 193 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos 130, 260, 261, 262, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(ii) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 130 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos 193, 260, 261, 262, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(iii) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 260 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos 130, 193, 261, 262, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(iv) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 261 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos 130, 193, 260, 262, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(v) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 262 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos 130, 193, 260, 261, 295, 415, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(vi) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 415 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos 130, 193, 260, 261, 262, 295, 416, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1,

(vii) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 416 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos 130, 193, 260, 261, 262, 295, 415, 417 o 512 de la SEQ ID NO: 1, o (viii) una sustitución en un residuo de aminoácido que corresponde al aminoácido 417 de la SEQ ID NO: 1 y opcionalmente una sustitución adicional en uno o más de los residuos de aminoácido que corresponden a los aminoácidos 130, 193, 260, 261, 262, 295, 415, 416, o 512 de la SEQ ID NO:1.

2. La vacuna de la reivindicación 1, en la que la SCP se expresa a partir de una secuencia de ADN aislada que codifica SCP.

3. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la SCP presenta una cavidad de especificidad de residuos de aminoácido contiguos correspondiente aproximadamente a los residuos entre el residuo 260 y el residuo 417 de la SEQ ID NO: 1, o un dominio catalítico de residuos de aminoácido contiguos correspondiente aproximadamente a los residuos entre el residuo 130 y el residuo 512 de la SEQ ID NO: 1.

4. La vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la sustitución es una sustitución conservada.

5. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la SCP variante varía adicionalmente de la SCP natural en que no contiene una secuencia señal y/o un injerto de pared celular.

6. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la SCP es una variante de SCP procedente de Estreptococos de grupo A, de Estreptococos de grupo B, de Estreptococos de grupo C o de Estreptococos de grupo G.

7. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende una cantidad eficaz de un adyuvante inmunológico.

8. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el mamífero es humano, perro, bovino, porcino o equino.

9. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el Estreptococo º-hemolítico es un Estreptococo de grupo A, un Estreptococo de grupo B, un Estreptococo de grupo C o un Estreptococo de grupo G.

10. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la SCP se conjuga o se une a un péptido

o a un polisacárido.

11. La vacuna de la reivindicación 10, en la que el péptido o polisacárido conjugado o unido a la SCP es de otro patógeno.

12. La vacuna de la reivindicación 11, en la que el polisacárido de otro patógeno es un polisacárido estreptococal

de grupo A, un polisacárido-C de Estreptococos de grupo B o un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae 5 o de Estreptococos de grupo B.

13. Uso de la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento para la protección contra la colonización o la infección de Estreptococos º-hemolíticos.

14. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para usar como un medicamento para la protección contra la colonización o la infección de Estreptococos º-hemolíticos.