Uso tanto de RD9 como de IS6110 como dianas de ácido nucleico para el diagnóstico de la tuberculosis, y provisión de dianas IS6110 y RD9 combinadas-adaptables.

Serie de cebadores, que comprende al menos dos pares de cebadores,

adecuados para la detección específica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC), y/o para la discriminación específica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado,

donde dichos dos pares de cebadores tienen secuencias tales que pueden usarse en combinación en una única ejecución de amplificación ofreciendo aún al mismo tiempo una detección y discriminación específicas y sensibles, donde dichos dos pares de cebadores son un par de cebadores de IS6110 que consiste en un cebador directo de IS61y un cebador inverso de IS6110, y un par de cebadores de RD9 que consiste en un cebador directo de RD9 10 y un cebador inverso de RD9,

donde dicho cebador directo de RD9 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleótidos de la secuencia de la SEC ID Nº 8, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleótido 5' de dicha SEC ID Nº 8,

donde dicho cebador inverso de RD9 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleótidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha SEC ID Nº 8 sobre la longitud completa de dicha SEC ID Nº 8, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleótido 5' de dicha secuencia complementaria,

donde dicho cebador directo de IS6110 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleótidos de la secuencia de la SEC ID Nº 2, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleótido 5' de dicha SEC ID Nº 2,

donde dicho cebador inverso de IS6110 es un fragmento 5'-terminal de 10 a 18 nucleótidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha SEC ID Nº 2 sobre la longitud completa de dicha SEC ID Nº 2, partiendo dicho fragmento 5'-terminal del primer nucleótido 5' de dicha secuencia complementaria.

Uso tanto de RD9 como de 156110 como dianas de acido nucleico para el diagnostico de la tuberculosis, y provision de dianas 156110 y RD9 combinadas-adaptables

Campo de la invención La presente se refiere a la tuberculosis, y mas particularmente al diagnostico de la tuberculosis. El recurso de la invencion hace uso tanto de RD9 como de 156110 como dianas de acido nucleico para el diagnostico de la tuberculosis. La presente invencion permite discriminar notablemente entre especies de Mycobacterium. Por tanto permite un diagnostico preciso, y de este modo proporciona una herramienta ventajosa para la seleccion del tratamiento apropiado. Sumario de la invención La presente invencion se refiere a la tuberculosis, y mas particularmente al diagnostico de la tuberculosis. El recurso de la invencion hace uso tanto de RD9 como de 156110 como dianas de acido nucleico para el diagnostico de la tuberculosis. La presente invencion de este modo proporciona un recurso que esta especificamente adaptado para la deteccion de micobacterias que pertenecen al complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) . El recurso de la invencion posibilita adicionalmente discriminar M. tuberculosis y M. canetti por un lado, de las otras cepas del MtbC (tal como M. bovis) por otro lado. De acuerdo con una caracteristica ventajosa, la presente invencion proporciona dianas RD9 e 156110 combinadasadaptables, que estan especialmente adaptadas a la aplicacion de una PCR combinada, de modo que dicha deteccion de MtbC y dicha discriminacion de especies puede conseguirse en una unica ejecucion de amplificacion. De acuerdo con la realizacion de PCR combinada, el recurso de la invencion permite ventajosamente la amplificacion de dos dianas de acido nucleico diferentes de forma combinada, concretamente una diana RD9 y una diana 156110. Con el recurso de la invencion, se necesita solamente una unica ejecucion de amplificacion para detectar una micobacteria que pertenece al MtbC, y para discriminar M. tuberculosis y M. canetti por un lado, de las otras cepas del MtbC por otro lado. El recurso de la invencion tambien tiene la ventaja de ser de rendimiento rapido y fiable: los resultados pueden estar disponibles el mismo dia que el dia de la recogida de la muestra del paciente. Adicionalmente es especifico, sensible y fiable. Antecedentes de la invención La Organizacion Mundial de la 5alud estima que un tercio de la poblacion global esta infectada con bacilos de tuberculosis, y que el 5-10% de las personas que estan infectadas con bacilos de tuberculosis (pero no estan infectados con V1H) llegan a estar enfermos o a ser infecciosos en algun momento durante su vida. 5e estima que se produjeron 1, 75 millones de muertes por tuberculosis en 2003. El V1H y los bacilos de tuberculosis adicionalmente forman una combinacion letal, acelerando cada uno el progreso del otro. Las cepas que son resistentes de forma natural a un farmaco anti-tuberculosis se han documentado en cada pais estudiado. Por ejemplo, M. bovis es resistente de forma natural a pirazidamida. Ademas, han surgido cepas de bacilos de tuberculosis que desarrollaron una resistencia a farmacos anti-tuberculosis principales principalmente debido a un cumplimiento discontinuo, parcial o irregular del tratamiento medico. Una forma particularmente peligrosa de tuberculosis resistente a farmacos es la tuberculosis resistente a multiples farmacos, que se define como la enfermedad causada por los bacilos de tuberculosis resistentes a al menos isoniazida y rifampicina, los dos farmacos anti-tuberculosis mas potentes. Las tasas de tuberculosis resistente a multiples farmacos son elevadas en algunos paises, especialmente en la antigua Union 5ºvietica, y amenazan los esfuerzos del control de la tuberculosis. Los bacilos que causan la tuberculosis en mamiferos (seres humanos y/o animales) son micobacterias que estan agrupadas dentro de lo que se conoce como el complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) . El complejo de Mycobacterium tuberculosis comprende notablemente las siguientes micobacterias: Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis (incluyendo el BCG-Bacilo de Calmette-Guerin-M. bovis atenuado) , Mycobacterium canetti, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti, Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium tuberculosis. Las micobacterias agrupadas en el complejo de Mycobacterium tuberculosis se caracterizan por una similitud del 99, 9% a nivel de nucleotidos y secuencias identicas de ARNr 165. A pesar del grado inusualmente elevado de conservacion en sus genes constitutivos, las micobacterias del complejo de Mycobacterium tuberculosis difieren ampliamente en terminos de tropismo de hospedador, fenotipos, y patogenicidad. Algunos son patogenos exclusivamente humanos (M. tuberculosis, M. africanum, M. canetti) , algunos son patogenos exclusivamente de roedores (M. microti) , mientras que otras pueden tener un amplio espectro de hospedador (M. bovis, M. caprae) . M. bovis y M. caprae pueden causar enfermedad en un amplio intervalo de animales domesticos o salvajes como ganado bovino y cabras, asi como en seres humanos. 5e ha informado de que M. microti infecta a roedores pequefos como topillos y mas recientemente tambien seres humanos (Niemann et al., 2000 Emerg. 1nfect. Dis. 6: 539-542; Kubica et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41 3070-3077.) . Parece que M. pinnipedii es el huesped natural para focas, aunque el organismo tambien es patogenico en cobayas, conejos, seres humanos, dantas (Tapirus terrestres) y, posiblemente, ganado bovino (Cousin et al., 2003, 1nt. J. 5yst. Evol. Microbiol. 53, 1305-1314) .

5e han identificado catorce regiones de diferencia, que varian en tamafo de 2 a 12, 7 kb, que estan ausentes de BCG de M. bovis, pero presentes en el genoma de M. tuberculosis H37Rv. 5e mencionan como RD1 a RD14 (vease Gordon et al. 1999, Mol. Microbiol. 32, 643-655; Behr et al. 1999, 5cience 284, 1520-1523) . La nomenclatura RD que se usa en este documento es la de Brosch et al. (Brosch et al.2000, Molecular Genetics of Mycobacteria, eds. Hatfull, G.F., y Jacobs, W.R., Jr. (Am. 5ºc. Microbiol., Washington, DC) , pag. 19-36) . Diez de dichas catorce regiones RD BCG-H37Rv+ estan altamente conservadas entre las cepas de M. tuberculosis, con relacion a otros miembros del complejo de Mycobacterium tuberculosis (RD1, RD2, RD4, RD7, RD8, RD9, RD10, RD12, RD13, RDM; Brosch et al. 2002, PNA5 U5A, 99 (6) , 3684-3689) .

5e han descrito seis regiones que estan ausentes del genoma de M. tuberculosis H37Rv, con relacion a otros miembros del complejo de Mycobacterium tuberculosis:

-cinco deleciones relacionadas con H37Rv, mencionadas como RvD1 a RvD5, y

-la region conocida como delecion 1 especifica de M. tuberculosis (TbD1) ,

(Gordon et al. 1999, Mol. Microbiol. 32, 643-655; Brosch et al. 1999, 1nfect. 1mmun. 67, 5768-5774) .

TbD1 se identifico originalmente como una region de 2.153-pb que estaba especificamente ausente del gen mmpL6 de casi todas las cepas de M. tuberculosis (Brosch et al. 2002, PNA5 U5A 99:3684-3689) . En base a la presencia o ausencia de la region TbD1, las cepas de M. tuberculosis pueden dividirse en tipos quot;ancestralesquot; y quot;modernosquot;, respectivamente. Las cepas de Beijing, Haarlem y Africana responsables de las mayores epidemias son tipos modernos (Kremer etal. 1999, J. Clin. Microbiol. 37, 2607-2618; Brosch et al. 2002, PNA5 U5A, 99 (6) , 3684-3689) .

Los signos clinicos y sintomas de tuberculosis no son suficientemente especificos para constituir en si y por si mismos un diagnostico fiable de tuberculosis.

Por lo tanto se realiza el diagnostico a traves del analisis de micobacterias de una muestra biologica, pretendido para detectar la presencia o ausencia de una micobacteria que pertenezca al MtbC.

5e han utilizado diversas caracteristicas micobacterianas biologicas y moleculares para identificar aislados de MtbC.

Tradicionalmente se ha usado una serie de ensayos clasicos basados en propiedades de crecimiento, fenotipicas y bioquimicas para segregar los miembros del MtbC (Haas et al. 1997, J. Clin. Microbiol. 35, 663-666; Niemann et al. 2000, J. Clin. Microbiol. 38, 3231-3234) .

5in embargo, estos ensayos pueden ser lentos, engorrosos, imprecisos, no reproducibles, y tardar mucho tiempo. Adicionalmente pueden no dar un resultado inequivoco en todos los casos, impidiendo de este modo su uso como herramienta de diagnostico para la tuberculosis.

Las herramientas actuales de deteccion para el diagnostico de la tuberculosis comprenden notablemente:

-microscopia (observacion directa y/o tincion celular) ,

-cultivo celular,

-un kit Gen-Probe®.

Las micobacterias son bastoncillos pleomorficos no moviles. Las colonias de M. bovis aparecen uniformes y disgenicas (es decir, colonias pequefas) , mientras que las colonias de M. tuberculosis son desiguales... [Seguir leyendo]

1. 5erie de cebadores, que comprende al menos dos pares de cebadores, adecuados para la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) , y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, donde dichos dos pares de cebadores tienen secuencias tales que pueden usarse en combinacion en una unica ejecucion de amplificacion ofreciendo aun al mismo tiempo una deteccion y discriminacion especificas y sensibles, donde dichos dos pares de cebadores son un par de cebadores de 156110 que consiste en un cebador directo de 156110 y un cebador inverso de 156110, y un par de cebadores de RD9 que consiste en un cebador directo de RD9 y un cebador inverso de RD9, donde dicho cebador directo de RD9 es un fragment.

5. terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia de la 5EC 1D N° 8, partiendo dicho fragment.

5. terminal del primer nucleotido 5' de dicha 5EC 1D N° 8, donde dicho cebador inverso de RD9 es un fragment.

5. terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de dicha 5EC 1D N° 8, partiendo dicho fragment.

5. terminal del primer nucleotido 5' de dicha secuencia complementaria, donde dicho cebador directo de 156110 es un fragment.

5. terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia de la 5EC 1D N° 2, partiendo dicho fragment.

5. terminal del primer nucleotido 5' de dicha 5EC 1D N° 2, donde dicho cebador inverso de 156110 es un fragment.

5. terminal de 10 a 18 nucleotidos de la secuencia que es completamente complementaria de dicha 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de dicha 5EC 1D N° 2, partiendo dicho fragment.

5. terminal del primer nucleotido 5' de dicha secuencia complementaria.

2. 5erie de cebadores de acuerdo con la reivindicacion 1, caracteriºada por ºue dicho cebador directo de RD9 comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 11.

3. 5erie de cebadores de acuerdo con la reivindicacion 1, caracteriºada por ºue dicho cebador inverso de RD9 comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 12.

4. 5erie de cebadores de acuerdo con la reivindicacion 1, caracteriºada por ºue dicho cebador directo de 156110 comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 5.

5. 5erie de cebadores de acuerdo con la reivindicacion 1, caracteriºada por ºue dicho cebador inverso de 156110 comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 6.

6. 5erie de dos polinucleotidos, donde uno de dichos dos polinucleotidos es un fragmento de RD9, siendo el otro un fragmento de 156110, donde dicho fragmento de RD9 consta de la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, y donde dicho fragmento de 156110 consta de la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2.

7. Composicion de amplificacion, que comprende la serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 15, y al menos uno de los dos siguientes amplicones:

- un amplicon 156110, que tiene un tamafo que varia de 190 a 210 nucleotidos, y que comparte un minimo del 95% de identidad de secuencia con la secuencia de la 5EC 1D N° 2 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2; -un amplicon RD9, que tiene un tamafo que varia de 160 a 185 nucleotidos, y que comparte un minimo del 95% de identidad de secuencia con la secuencia de la 5EC 1D N° 8 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8.

8. La composicion de amplificacion de la reivindicacion 7, que comprende al menos uno de los dos siguientes amplicones:

- un amplicon 156110, que tiene un tamafo que varia de 199 a 203 nucleotidos, y que comparte un minimo del 98% de identidad de secuencia con la secuencia de la 5EC 1D N° 2 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2; -un amplicon RD9, que tiene un tamafo que varia de 170 a 174 nucleotidos, y que comparte un minimo del 98% de identidad de secuencia con la secuencia de la 5EC 1D N° 8 o con la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8.

9. La composicion de amplificacion de la reivindicacion 7 u 8, que comprende dicho amplicon 156110 y dicho amplicon RD9.

10. Uso de una sonda en la deteccion de un amplicon producido in vitro por la serie de cebadores de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicha sonda es:

i) la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 8 o de dicha secuencia complementaria, o ii) la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 2 o de dicha secuencia complementaria.

11. El uso de la reivindicacion 10, donde dicho amplicon esta contenido en una composicion de amplificacion que comprende la serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

12. El uso de reivindicacion 10 u 11, donde dicho amplicon esta contenido en la composicion de amplificacion de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, donde dicha deteccion del amplicon se usa para el diagnostico in vitro de la tuberculosis o para la deteccion de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) en una muestra biologica.

14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde dicha sonda es un fragmento de la secuencia que es complementaria a la 5EC 1D N° 8, donde dicho fragmento comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 9.

15. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde dicha sonda es un fragmento de la 5EC 1D N° 2, donde dicho fragmento comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 3.

16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, donde dicha sonda comprende adicionalmente al menos un brazo de baliza.

17. El uso de acuerdo con la reivindicacion 16, donde dicha sonda es la secuencia de la 5EC 1D N° 10.

18. El uso de acuerdo con la reivindicacion 16, donde dicha sonda es la secuencia de la 5EC 1D N° 4.

19. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-18, donde dicha sonda comprende adicionalmente un fluoroforo en su extremo 5' y/o un inactivador en su extremo 3'.

20. Uso de al menos dos sondas en el diagnostico in vitro de la tuberculosis o en la deteccion de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) en una muestra biologica o para discriminar Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, donde una de dichas al menos dos sondas es:

i) la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 8 o de dicha secuencia complementaria,

y donde la otro de dichas al menos dos sondas es:

ii) la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2, o un fragmento de al menos 15 nucleotidos y de menos de 29 nucleotidos de dicha secuencia de la 5EC 1D N° 2 o de dicha secuencia complementaria.

21. El uso de la reivindicacion 20, donde dicha sonda definida en la reivindicacion 20 i) es un fragmento de la secuencia que es complementaria a la 5EC 1D N° 8, donde dicho fragmento comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 9.

22. El uso de la reivindicacion 20 o 21, donde dicha sonda definida en la reivindicacion 20 ii) es un fragmento de la 5EC 1D N° 2 que comprende la secuencia de la 5EC 1D N° 3.

23. El uso de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 22, donde cada una de dichas al menos dos sondas comprende adicionalmente al menos un brazo de baliza.

24. El uso de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 23, donde cada una de dichas al menos dos sondas comprende adicionalmente un fluoroforo en su extremo 5' y/o un inactivador en su extremo 3'.

25. 5erie de PCR, que consiste en al menos una sonda, cuya secuencia es la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, y en la serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

26. Kit para la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) , y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, caracteriºado por ºue comprende:

- al menos una serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y/o

- al menos una serie de dos polinucleotidos de la reivindicacion 6.

27. Kit para el diagnostico in vitro de la tuberculosis, caracteriºado por ºue comprende al menos uno entre los siguientes elementos:

- al menos una serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

- al menos una serie de dos polinucleotidos de la reivindicacion 6.

28. El kit de la reivindicacion 26 o 27, que comprende adicionalmente al menos una sonda, cuya secuencia es la definida en una cualquiera de las reivindicaciones 10-19.

29. El kit de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 28, que comprende adicionalmente un oligonucleotido o polinucleotido adecuado para su uso como control interno (1C) en la deteccion especifica y sensible de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) , y/o para la discriminacion especifica y sensible de Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, caracteriºado por ºue dicho oligonucleotido o polinucleotido 1C comprende:

a. dos secuencias de sitio de union a cebador, donde una de dichas dos secuencias de sitio de union a cebador que esta localizada en 5' con relacion a la otra de dichas dos secuencias de sitio de union a cebador es identica a un miembro de un par de cebadores seleccionado entre los dos pares de cebadores definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y la otra de dichas dos secuencias de sitio de union a cebador es completamente complementaria al otro miembro del mismo par de cebadores seleccionado, y

b. una secuencia que no esta relacionada con Mycobacterium, que esta localizada entre dichas dos secuencias de sitio de union a cebador;

y/o la sonda 1C de la 5EC 1D N° 14.

30. El kit de la reivindicacion 29, donde la secuencia de dicho oligonucleotido 1C es la secuencia de la 5EC 1D N° 13.

31. El kit de una cualquiera de las reivindicacione.

2. 30, caracteriºado por ºue comprende adicionalmente un tampon de lisis para la extraccion del acido nucleico.

32. Kit de acuerdo con la reivindicacion 31, caracteriºado por ºue dicho tampon de lisis contiene una resina anionica que se une a iones divalentes.

33. Metodo para detectar una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) en una muestra biologica, y/o para discriminar Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado, caracteriºado por ºue comprende la deteccion de dos secuencias de acido nucleico diana por PCR usando los dos pares de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 como cebadores de amplificacion, donde una de dichas dos secuencias diana es 156110 o un fragmento de la misma, y la otra secuencia diana es RD9 o un fragmento de la misma, donde la deteccion de la presencia de dicha diana RD9 y de la presencia o ausencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. tuberculosis o M. canetti, donde la deteccion de la ausencia de dicha diana RD9 y de la presencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que no es M. tuberculosis, donde la deteccion de la ausencia de dicha diana RD9 y la ausencia de dicha diana 156110 es indicativa de la ausencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC.

34. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 33, caracteriºado por ºue dicha secuencia diana RD9 consta de la secuencia de la 5EC 1D N° 8, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 8 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 8, y dicha secuencia diana 156110 consta de la secuencia de la 5EC 1D N° 2, o la secuencia que es completamente complementaria a la 5EC 1D N° 2 sobre la longitud completa de la 5EC 1D N° 2.

35. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 33 o 34, caracteriºado por ºue la deteccion de la presencia de dicha diana RD9 y de la ausencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. canetti, o una cepa ancestral de M. tuberculosis.

36. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

3. 35, caracteriºado por ºue la deteccion de la presencia de dicha diana RD9 y de la presencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha

muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. canetti, o una cepa de tipo moderno de M. tuberculosis.

37. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

3. 36, caracteriºado por ºue la deteccion de la ausencia de dicha diana RD9 y de la presencia de dicha diana 156110 es indicativa de la presencia en dicha muestra biologica de una micobacteria que pertenece al MtbC, que es M. bovis, M. africanum, M. caprae, M. microti, o M. pinnipedii.

38. Metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

3. 37, caracteriºado por ºue dicha PCR se implementa en combinacion.

39. El metodo de una cualquiera de las reivindicacione.

3. 38, caracteriºado por ºue dicha PCR se implementa usando al menos una sonda, cuya secuencia se define en una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, como sonda de deteccion.

40. El metodo de una cualquiera de las reivindicacione.

3. 39, donde la composicion de amplificacion producida por dicha PCR comprende un amplicon producido por uno de dichos dos pares de cebadores y/o un amplicon producido por el otro de dichos dos pares de cebadores.

41. El metodo de una cualquiera de las reivindicacione.

3. 40, donde la composicion de amplificacion producida por dicha PCR comprende uno o los dos amplicones definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 7-9.

42. Metodo in vitro para el diagnostico de la tuberculosis, caracteriºado por ºue la presencia o ausencia de una micobacteria del MtbC en una muestra biologica, y/o la presencia o ausencia de una cepa de M. tuberculosis o M. canetti en una muestra biologica, y/o la presencia o ausencia de una micobacteria del MtbC, que no es M. tuberculosis, en una muestra biologica, se determina por implementacion del metodo de una cualquiera de las reivindicacione.

3. 41 sobre dicha muestra biologica.

43. Uso de:

- al menos una serie de cebadores de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y/o

- al menos una serie de dos polinucleotidos de la reivindicacion 6,

en el diagnostico in vitro de la tuberculosis o en la deteccion de una micobacteria del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MtbC) en una muestra biologica o para discriminar Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium canetti por un lado, de las otras cepas de dicho MtbC por otro lado.