Procedimiento de detección simultánea de un antígeno y de un anticuerpo de un microorganismo infeccioso.

Procedimiento de detección in vitro de una infección por un microorganismo en una muestra biológica,

quecomprende la detección simultánea de al menos un antígeno de dicho microorganismo y de un anticuerpo dirigidocontra dicho microorganismo, presentes en la muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:

a) disponer la muestra biológica con un anticuerpo de captura dirigido contra dicho microorganismo inmovilizadosobre una fase sólida, y un antígeno de captura derivado de dicho microorganismo inmovilizado sobre unafase sólida;

b) incubar la mezcla en condiciones que permiten la formación de complejos antígenos-anticuerpos;

c) revelar los complejos antígenos-anticuerpos formados, que utilizan un anticuerpo de detección, marcado,capaz de unirse al antígeno de dicho microorganismo capturado, y/o eventualmente también un antígeno dedetección, marcado, capaz de unirse al anticuerpo dirigido contra dicho microorganismo capturado;

y en el que el antígeno de captura y/o el antígeno de detección, marcado, de dicho microorganismocomprende un fragmento antigénico de dicho microorganismo del cual al menos un epítopo está destruido,haciendo que sea incapaz de ser reconocido por el anticuerpo de captura y/o de detección dirigido contra elantígeno y al mismo tiempo capaz de unirse a los anticuerpos dirigidos contra el microorganismo, porreconocimiento de otros sitios epitópicos que permanecen intactos;

y el anticuerpo de captura y/o de detección, que son unos anticuerpos monoclonales o policlonalesmonoespecíficos, reconoce dicho al menos un epítopo, intacto, del antígeno capturado.

Procedimiento de detección simultánea de un antígeno y de un anticuerpo de un microorganismo infeccioso.

La invención se refiere a la detección in vitro de una infección por un microorganismo infeccioso, especialmente viral, y en particular la detección in vitro de una infección por un virus de la hepatitis C (VHC) . La invención se refiere más precisamente también a un procedimiento de detección simultánea de un antígeno de un microorganismo infeccioso, en particular viral, y de anticuerpos dirigidos contra este mismo microorganismo infeccioso así como los reactivos y kits que lo aplican. Más particularmente, se refiere a un procedimiento de detección simultánea de antígeno VHC y de anticuerpos anti-VHC, y los reactivos y kits que lo aplican.

La infección por el virus de la hepatitis C, una hepatitis inicialmente denominada hepatitis No-A, No-B es un problema de salud preocupante y reconocido desde hace mucho tiempo, en particular en transfusión sanguínea.

La solicitud de patente EP 318 216 publicada el 31 de mayo de 1989 describe la clonación de fragmentos del ADNc de un virus responsable de la hepatitis C en el ser humano, denominado HCV (en inglés) o VHC (en español) . Describe asimismo la secuencia de cinco genes que codifican las proteínas no estructurales (NS1 a NS5) del virus (aproximadamente el 78% del genoma total del VHC) , el antígeno C100-3 (que contiene 363 aminoácidos de la región NS3-NS4 y fusionado al superóxido dismutasa) así como a un procedimiento de detección de anticuerpos anti-VHC con la ayuda del antígeno C100-3. Este procedimiento de detección de anticuerpos anti-VHC, denominado de primera generación, ha permitido, entre otros, establecer que el VHC es la principal causa de la hepatitis No-A, No-B, ahora denominada hepatitis C, en el mundo. Sin embargo, este procedimiento no permite detectar más del 70 al 80% de los sueros infectados por el virus. Esta falta de sensibilidad no permite tampoco una detección precoz de las infecciones.

Okamoto et al. (1990a) y la solicitud de patente EP 388 232 publicada el 19 de septiembre de 1990 describen la secuencia terminal 5' del genoma del virus VHC, es decir la secuencia de los genes que codifican las proteínas estructurales (cápside, matriz, envoltura) del virus responsable de la hepatitis C.

Okamoto et al. (1990b) publican la utilización de la secuencia de aminoácidos 39-74 del cápside del VHC como diana de detección ELISA de anticuerpos anti-VHC.

El artículo Hosein et al. (1991) describe un inmunoensayo de detección de anticuerpos anti-VHC fundado en el uso de antígenos peptídicos sintéticos estructurales (cápside: en la región AA 1-120) y no estructurales (ND3-NS4: en la región AA 1200-1800) . Demuestra el interés de los péptidos sintéticos en la detección de anticuerpos anti-VHC y de la combinación de los antígenos estructurales y no estructurales: aumenta la sensibilidad, y por lo tanto la precocidad, de la detección. El ensayo descrito aquí permite una detección de anticuerpos más precoz de 4 a 10 semanas. El artículo muestra también que no existe epítopo inmunodominante principal, como se conoce, por ejemplo, del virus del SIDA.

Nasoff et al. (1991) constatan que la mayoría de los epítopos inmunorreactivos dominantes de la cápside están localizados en la región N-terminal (AA 1-40) y que los anticuerpos dirigidos contra estos epítopos aparecen precozmente después de la infección.

Los ensayos de detección de anticuerpos anti-VHC denominados de segunda generación (es decir fundados sobre la utilización simultánea de antígenos de captura no estructurales y estructurales) constituyen un progreso significativo frente a ensayos de primera generación. Sin embargo, carecen todavía de sensibilidad: detectan en efecto como mucho el 95 al 98% de los sueros extraídos en pacientes contaminados por el VHC. Por consiguiente, esta detección es todavía demasiado poco precoz y deja también pasar desapercibidas donaciones de sangre infectada en transfusión sanguínea. En efecto, para reducir los riesgos post-transfusionales, es necesario detectar la presencia del virus en sí mismo, antes de la aparición de anticuerpos, y lo más pronto posible después de la contaminación. Este periodo entre la contaminación y la seroconversión (es decir la aparición de anticuerpos) se denomina "ventana serológica".

Diferentes equipos (Garson et al. (1990) ; Shiel et al. (1991) ) han propuesto la detección del ARN viral por la PCR (reacción en cadena por la polimerasa) para resolver el problema de sensibilidad y de precocidad evocada antes. Este método permite en efecto una detección extremadamente sensible y precoz de la infección por VHC, es decir sólo algunos días después de la exposición al virus, es decir 4 a 8 semanas antes de la elevación de los anticuerpos antivirales circulantes. Constituye actualmente el método de referencia para la detección del virus en los fluidos biológicos.

Sin embargo, el método de PCR aplicado al VHC se enfrenta a diversas dificultades. Por un lado, implica la realización de pre-etapas de extracción, purificación del ARN, y después transcripción inversa del ARN en ADNc, y una parte del material viral se pierde durante estas etapas previas. Por otro lado, requiere un equipamiento de amplificación específico y costoso. Además, no permite tratar simultáneamente un gran número de muestras y da frecuentemente lugar a contaminaciones.

Otro enfoque, para la detección precoz de la infección por el VHC, consistió en la detección del antígeno viral (cápside) circulante. Este antígeno aparece también varias semanas antes de la aparición de los anticuerpos anti-VHC séricos. Takahashi et al., (1992) describen una técnica ELISA que detecta el antígeno de la cápside con la ayuda de una pareja de anticuerpos.

Sin embargo, la detección de este antígeno es difícil de elaborar debido, en su gran parte, al bajo índice de antígeno detectable en la sangre y a la calidad de los reactivos inmunológicos disponibles.

Hajime Tokita et al. (2000) describen un inmunoensayo de tipo sándwich con la ayuda de una pareja de anticuerpos monoclonales (5F11 y 5E3) , conocido en el mercado bajo el nombre de "Immucheck F HCV Ag Core Kokusai", de detección muy sensible. Los autores de este artículo subrayan que una mutación Thr49Pro en la proteína de la cápside reduce la sensibilidad del ensayo. Buscando igualmente detectar el antígeno de la cápside en un estado precoz, Peterson et al. (2000) exponen una técnica de detección ELISA del antígeno de la cápside del VHC con la ayuda de anticuerpos monoclonales anti-cápside, sin pretratamiento de la muestra. El artículo muestra, gracias a la comparación de tres ensayos independientes (detección del ARN del VHC por la PCR, de los anticuerpos anti-VHC y del antígeno de la cápside por ELISA) , que así el antígeno de la cápside circulante del VHC puede ser detectado útilmente en bolsas de sangre extraída durante la fase seronegativa precoz de la infección (es decir aproximadamente 1 días después de la detección del ARN) .

La precocidad de la detección de la infección por el virus de la hepatitis C asociada a la posibilidad de detectar las respuestas anticuerpos posteriores a la seroconversión en toda la duración de la infección sigue siendo un objetivo en la actualidad, muy particularmente en transfusión.

En la óptica de disponer de un método simple, sensible, específico, reproducible, barato y de realización fácil, automatizable - en vista a la detección de masa - para detectar, en primer lugar el antígeno VHC durante el tiempo de la ventana serológica, y después seguir la evolución serológica del paciente después de la seroconversión, combinar una detección unos anticuerpos anti-VHC y una detección de antígeno de VHC es muy deseable.

Sin embargo, esto plantea un problema mayor, el de la interferencia, sobre la determinación del antígeno de VHC, entre los anticuerpos anti-VHC presentes en el suero y unos anticuerpos anti-VHC marcados. Así, la introducción sobre una fase sólida, en vista a la detección de un anticuerpo dado, de un antígeno diana que tendría los mismos epítopos que los reconocidos por el o los anticuerpos marcados, utilizados en vista a la detección simultánea en sándwich de un antígeno, conllevaría irremediablemente una fijación de anticuerpos marcados sobre la fase sólida y por lo tanto una respuesta falsamente positiva del ensayo.

Este es particularmente el caso en un sistema de detección simultáneo, en la misma fase sólida, de anticuerpos anticápside del VHC y de antígeno de cápside del VHC. Así, el depósito sobre la fase sólida, en vista a la detección de anticuerpos anticápside... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de detección in vitro de una infección por un microorganismo en una muestra biológica, que comprende la detección simultánea de al menos un antígeno de dicho microorganismo y de un anticuerpo dirigido 5 contra dicho microorganismo, presentes en la muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:

a) disponer la muestra biológica con un anticuerpo de captura dirigido contra dicho microorganismo inmovilizado sobre una fase sólida, y un antígeno de captura derivado de dicho microorganismo inmovilizado sobre una fase sólida;

b) incubar la mezcla en condiciones que permiten la formación de complejos antígenos-anticuerpos;

c) revelar los complejos antígenos-anticuerpos formados, que utilizan un anticuerpo de detección, marcado, capaz de unirse al antígeno de dicho microorganismo capturado, y/o eventualmente también un antígeno de 15 detección, marcado, capaz de unirse al anticuerpo dirigido contra dicho microorganismo capturado;

y en el que el antígeno de captura y/o el antígeno de detección, marcado, de dicho microorganismo comprende un fragmento antigénico de dicho microorganismo del cual al menos un epítopo está destruido, haciendo que sea incapaz de ser reconocido por el anticuerpo de captura y/o de detección dirigido contra el antígeno y al mismo tiempo capaz de unirse a los anticuerpos dirigidos contra el microorganismo, por reconocimiento de otros sitios epitópicos que permanecen intactos;

y el anticuerpo de captura y/o de detección, que son unos anticuerpos monoclonales o policlonales monoespecíficos, reconoce dicho al menos un epítopo, intacto, del antígeno capturado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo se selecciona de entre el grupo constituido por virus, bacterias y parásitos microbianos.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el microorganismo es un virus de la hepatitis C (VHC) .

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el antígeno de captura comprende un fragmento antigénico de la proteína de la cápside del VHC, en el que al menos un sitio epitópico está destruido.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que el antígeno de captura comprende un fragmento 35 antigénico de la proteína no estructural del VHC NS3 o NS4.

6. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el microorganismo es un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) .

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el VIH es un VIH-1 y/o un VIH-2.

8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7, en el que el antígeno de captura comprende un fragmento antigénico de la proteína gag del VIH, en el que al menos un sitio epitópico está destruido.

9. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7, en el que el antígeno de captura comprende un fragmento antigénico de una proteína de envoltura del VIH.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que el antígeno de captura contiene al menos dos sitios epitópicos diferentes destruidos.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en el que el antígeno de captura contiene un sitio epitópico destruido por sustitución, deleción o inserción, de al menos un aminoácido.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que el anticuerpo de detección se añade a 55 la mezcla después de que los complejos antígenos-anticuerpos se hayan formado.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en el que el anticuerpo de detección y/o el antígeno de detección, está dispuesto en la muestra biológica al mismo tiempo que el anticuerpo de captura y el antígeno de captura.

14. Procedimiento según la reivindicación 3, que comprende

a) disponer la muestra biológica con un anticuerpo de captura del VHC y un antígeno de captura del VHC fijados sobre una fase sólida;

b) incubar la mezcla en condiciones que permiten la formación de complejos antígenos-anticuerpos;

c) separar la fase sólida y de la fase líquida;

d) poner en contacto la fase sólida con, por un lado, un anticuerpo de detección, marcado, capaz de unirse al antígeno de VHC capturado y, por otro lado, un anticuerpo, anti-inmunoglobulina o anti-isotipo, o un antígeno de detección, marcado, capaz de unirse al anticuerpo anti-VHC capturado,

comprendiendo el antígeno de captura y el antígeno de detección, de anticuerpos anti-VHC unos fragmentos antigénicos de la proteína de la cápside del VHC, de los cuales se han destruido dos epítopos,

y los anticuerpos de captura y de detección que reconocen cada uno de dichos epítopos, intactos, del antígeno de la cápside capturado.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección que reconocen cada uno un epítopo seleccionado de entre el grupo de epítopos de secuencias siguientes:

44LGVR47 (SEC ID nº 19) , 30IVGGVYL36 (SEC ID nº 20) y 29QIVGGV34 (SEC ID nº 21) .

16. Procedimiento de detección según la reivindicación 6 ó 7, que comprende:

a) presentar la muestra biológica con un anticuerpo de captura del VIH y un antígeno de captura del VIH fijados sobre una fase sólida;

b) incubar la mezcla en condiciones que permiten la formación de complejos antígenos-anticuerpos;

c) separar la fase sólida y de la fase líquida;

d) poner en contacto la fase sólida con un anticuerpo de detección, marcado, capaz de unirse al antígeno de VIH capturado y, uno o más anticuerpos, anti-inmunoglobulina o anti-isotipo, marcado, capaz de unirse al anticuerpo anti-VIH capturado,

comprendiendo el antígeno de captura de anticuerpo anti-VIH un fragmento antigénico de la proteína gag del VIH, del cual se ha destruido al menos un epítopo,

y los anticuerpos de captura y de detección que reconocen cada uno uno de dichos epítopos, intactos, del antígeno de la cápside capturado.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección reconocen cada uno un epítopo de secuencia QASQEVKNWMTETLL (SEC ID nº 24) .

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que la presentación de la muestra biológica con dicho anticuerpo de captura y dicho antígeno de captura fijados sobre una fase sólida se realiza en presencia de al menos un detergente de tipo no iónico.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicho detergente no iónico es el NP40.

20. Kit útil para la detección de una infección por un virus de la hepatitis C (VHC) o un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en una muestra biológica, que comprende:

- un antígeno de captura, inmovilizado sobre una fase sólida, que comprende un fragmento antigénico de una proteína de dicho VHC o VIH, comprendiendo dicho fragmento al menos un epítopo destruido, haciendo que sea incapaz de ser reconocido por un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección dirigidos contra dicho al menos un epítopo, intacto, seleccionado de entre el grupo de los epítopos de secuencias siguientes:44LGVR47 (SEC ID nº 19) , 30IVGGVYL36 (SEC ID nº 20) , 29QIVGGV34 (SEC ID nº 21) , QASQEVKNWMTETLL (SEC ID nº 24) y QTDPAVKNWMTQTLL (SEC ID nº 25) , y conservar al mismo tiempo la capacidad de unirse a los anticuerpos dirigidos contra el microorganismo eventualmente presente en la muestra biológica, por reconocimiento de otros sitios epitópicos que permanecen intactos;

- dicho anticuerpo de detección, monoclonal o policlonal monoespecificado, dirigido contra dicho al menos un epítopo, intacto, de dicha proteína del VHC o VIH; y

- dicho anticuerpo de captura monoclonal o policlonal monoespecífico, inmovilizado sobre una fase sólida, dirigido contra dicho al menos un epítopo, intacto, de dicha proteína del VHC o VIH;

siendo dicha proteína del VHC la proteína de cápside del VHC y el anticuerpo de captura y/o de detección que reconoce un epítopo seleccionado de entre el grupo de epítopos de secuencias siguientes: 44LGVR47

(SEC ID nº 19) , 30LVGGVYL36 (SEC ID nº 20) y 29QIVGGV34 (SEC ID nº 21) , o siendo dicha proteína del VIH la proteína P25 del VIH-1 y el anticuerpo de captura y/o de detección que reconoce el epítopo de secuencia QASQEVKNWMTETLL (SEC ID nº 24) , o siendo dicha proteína del VIH la proteína P26 del VIH-2 y el anticuerpo de captura y/o de detección que reconoce el epítopo de secuencia QTDPAVKNWMTQTLL (SEC ID nº 25) .

21. Kit según la reivindicación 20, en el que dichos anticuerpos de captura y de detección están dirigidos contra un epítopo idéntico, intacto, de dicha proteína del VHC o VIH.

22. Kit según la reivindicación 20, en el que

- dicho antígeno de captura comprende un fragmento antigénico de dicha proteína de dicho VHC o VIH,

haciendo que dicho fragmento, que comprende al menos dos epítopos destruidos, sea incapaz de ser reconocido por dicho anticuerpo de captura y dicho anticuerpo de detección, y

- dicho anticuerpo de captura es dirigido contra uno de dichos dos epítopos, intactos, de dicha proteína del VHC o VIH, mientras que el anticuerpo de detección es dirigido contra el otro de dichos dos epítopos, intactos, de dicha proteína del VHC o VIH.

23. Kit según una de las reivindicaciones 20 a 22, que comprende, además el antígeno de captura, un medio de detección de dichos anticuerpos anti-VHC presentes en la muestra biológica y que forman complejos con dicho antígeno de captura.

24. Kit según una de las reivindicaciones 20 a 22, que comprende, además del antígeno de captura, un medio de detección de dichos anticuerpos anti-VIH presentes en la muestra biológica y que forman complejos con dicho antígeno de captura.

25. Kit según la reivindicación 23 ó 24, en el que el medio de detección es un anticuerpo anti-inmunoglobulina o antiisotipo marcado.

26. Kit según una de las reivindicaciones 20 a 23, que comprende:

a) un antígeno de captura que comprende un fragmento antigénico de una proteína del VHC, comprendiendo dicho fragmento por lo menos dos epítopos destruidos, y conservando al mismo tiempo la capacidad de unirse a los anticuerpos anti-VHC eventualmente presentes en una muestra biológica;

b) un anticuerpo de captura dirigido contra uno de dichos epítopos, intactos, de dicha proteína del VHC; siendo dicho antígeno de captura y dicho anticuerpo de captura inmovilizados en una fase sólida; y

c1) un anticuerpo de detección, marcado, dirigido contra otro de dichos epítopos, intactos, de dicha proteína del VHC, y/o 45 c2) eventualmente un antígeno de detección, marcado, que es un fragmento antigénico de una proteína del VHC, comprendiendo dicho fragmento al menos un epítopo destruido, y que conserva al mismo tiempo la capacidad de unirse con los anticuerpos anti-VHC eventualmente presentes en una muestra biológica.

27. Kit según la reivindicación 25, que comprende:

a) el antígeno de captura, que comprende un fragmento antigénico de una proteína del VIH, comprendiendo dicho fragmento al menos un epítopo destruido, y que conserva al mismo tiempo la capacidad de unirse a los anticuerpos anti-VIH eventualmente presentes en una muestra biológica;

b) un anticuerpo de captura dirigido contra uno de dichos epítopos, intactos, de dicha proteína del VIH;

siendo dicho antígeno de captura y dicho anticuerpo de captura inmovilizados en una fase sólida;

c1) un anticuerpo de detección, marcado, dirigido contra otro de dichos epítopos, intactos, de dicha proteína del VIH,

c2) y/o eventualmente un antígeno de detección, marcado, que es un fragmento antigénico de una proteína del VIH, comprendiendo dicho fragmento al menos un epítopo destruido, y que conserva al mismo tiempo la capacidad de unirse con los anticuerpos anti-VIH eventualmente presentes en una muestra biológica.

28. Kit según una de las reivindicaciones 20 a 27, que comprende además, al menos un detergente de tipo no iónico.

29. Kit según la reivindicación 28, en el que dicho detergente de tipo no iónico es el NP40.

30. Péptido o polipéptido procedente de la proteína de la cápside del VHC, que lleva al menos un sitio epitópico 5 intacto y que comprende cualquiera de las secuencias SEC ID nº 4 a SEC ID nº 18.

31. Péptido o polipéptido procedente de la proteína gag de un VIH que lleva al menos un sitio epitópico intacto y que comprende la secuencia SEC ID nº 22.