USO DE SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS QUE CODIFICAN PIROFOSFATASAS TRANSLOCADORAS DE PROTONES PARA PRODUCIR LEVADURAS, HONGOS Y CÉLULAS ANIMALES RESISTENTES A FÁRMACOS CITOTÓXICOS Y FUNGICIDAS Y MÉTODO PARA PRODUCIRLAS.

La presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos de origen vegetal o microbiano que codifica para una secuencia de aminoácidos correspondiente a una pirofosfatasa translocadora de protones (H+-PPasa,

miembro de una familia de proteínas con código identificativo PF03030 de la base de datos Pfam), la cual es usada para transformar o transfectar una célula de levadura (p.e. Saccharomyces cerevisiae), fúngica o animal que naturalmente no contienen esta clase de proteínas, con la finalidad de producir resistencia a fármacos o antibióticos citotóxicos y a fungicidas.

Uso de secuencias nucleotídicas que codifican pirofosfatasas translocadoras de protones para producir levaduras, hongos y células animales resistentes a fármacos citotóxicos y fungicidas, y método para producirlas.

La invención concierne a la biomedicina (medicina clínica, industria biomédica) , y a los sectores farmacéutico, biotecnológico (en los ámbitos agroalimentario, químico, petroquímico, bioenergías) y medioambiental. La invención genera productos biológicos aplicables en medicina regenerativa y cirugía (trasplantes; producción de órganos, tejidos y células animales modificados) , en biotransformaciones industriales (producción de antibióticos, agroquímicos, biocombustibles, medicamentos, petroquímicos, plásticos) y agroalimentarias (bebidas alcohólicas, conservación de alimentos) , en descontaminación y reciclaje, así como en cualesquiera otras aplicaciones que impliquen transformaciones por cultivos de células animales o microorganismos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El pirofosfato inorgánico (PPi) es un componente celular producido por todos los organismos vivos que se genera en muchas reacciones anabólicas de biosíntesis de polímeros y metabolitos. Su hidrólisis es esencial para que esas reacciones discurran en la dirección correcta y se regenere el Pi necesario para las reacciones de fosforilación. La hidrólisis del PPi es, por tanto, una reacción bioquímica universal que se ha mantenido a lo largo de la evolución, aunque las proteínas enzimáticas que la catalizan (pirofosfatasas inorgánicas, PPasas, EC 3.6.1.1) difieren considerablemente en su secuencia de aminoácidos, estructura y mecanismo catalítico.

Las PPasas se dividen en dos grandes grupos: las solubles (sPPasas; 20-30 kDa) citosólicas o de organelos, que hidrolizan el PPi generando calor y las PPasas translocadoras de protones (H+-PPasas, 70 kDa) , proteínas integrales de membrana que utilizan la energía de hidrólisis del PPi -un compuesto rico en energía química, igual que el ATP-para generar un gradiente electroquímico de protones a través de membranas biológicas, una forma de energía muy versátil y útil para la energética celular (Baltscheffsky y col. 1999; Pérez-Castiñeira y col. 2001a y b, y 2002; Serrano y col. 2004 y 2007) . Las H+-PPasas son, por tanto, bombas primarias de protones que se encuentran en la membrana plasmática de procariotas y en las membranas endocelulares (sistema Golgi, lisosomas, vacuolas) de eucariotas, por lo que está implicada en la homeostasis de iones y otros procesos relacionados con el tráfico intracelular de membranas. Se han identificado H+-PPasas en muchas bacterias (p.e., la bacteria fotosintética Rhodospirillum rubrum) , arqueas, protistas (eucariotas unicelulares) y en todos los vegetales analizados hasta la fecha (algas, musgos, helechos y plantas mono-y di-cotiledóneas) (Pérez-Castiñeira y col. 2001a) . Sin embargo, hasta la fecha no se ha demostrado la presencia de genes que codifican para H+-PPasas en levaduras u otros hongos, ni en metazoos (animales multicelulares) .

La acidificación de los compartimentos endocelulares delimitados por una única membrana (retículo endoplasmático, sistema Golgi, endosomas, lisosomas y vacuolas) impulsa un tráfico intracelular de membranas y proteínas que es vital para todas las células eucarióticas (Hernández y col, 2010) . En levaduras, hongos y animales esta acidificación está promovida por la ATPasa translocadora de H+ vacuolar (V-ATPasa) , una compleja bomba de protones formada por múltiples subunidades cuya funcionalidad es esencial para estos organismos (Hernández y col, 2010) . En la membrana vacuolar (tonoplasto) y otras endomembranas de plantas superiores, algas y muchos protistas (eucariotas unicelulares) se localiza también la H+-PPasa (Maeshima 2000) , la cual al acoplar el bombeo de H+ a la hidrólisis del PPi citosólico genera una fuerza protón-motriz, con un potencial positivo en el lumen, de magnitud similar al generado por la V-ATPasa localizada en las mismas endomembranas. Estos organismos poseen, por tanto, dos tipos de bombas de H+ que realizan funciones aparentemente redundantes, aunque con sustratos energéticos diferentes (Rea y col. 1992; Maeshima 2000, Pérez-Castiñeira y col. 2001a) . El hecho de que los niveles celulares de adenilatos sean muy sensibles a condiciones desfavorables, mientras que los de PPi apenas se alteran, estaría de acuerdo con el papel propuesto para la H+-PPasa en una bioenergética de estrés (Serrano y col. 2007) . Los hongos y metazoos son excepciones a este respecto al carecer naturalmente de H+-PPasas, hidrolizando el PPi citosólico mediante una sPPasa que debe ser inactivada para asegurar la funcionalidad de las H+-PPasas en el sistema de expresión heterólogo fúngico o animal (Pérez-Castiñeira y col. 2002) .

Las H+-PPasas son proteínas hidrofóbicas relativamente grandes, con 15-17 segmentos alfa-hélice transmembranales y de unos 750-800 residuos de aminoácidos. Su N-terminal se prevé en el lumen vacuolar, mientras que el C-terminal se cree que se localiza en el citosol. Bioquímicamente se clasifican en dos grandes grupos, dependiente de si su actividad catalítica es estimulada o no por potasio (Maeshima 2000, Drozdowicz y Rea 2001; Pérez-Castiñeira y col 2001a y b) . Varios residuos ácidos son importantes para la función de la H+-PPasa de la planta Arabidopsis thaliana y la bacteria Streptomyces coelicolor. Algunas plantas, protistas y procariotas poseen isoformas de H+-PPasa estrechamente relacionadas (Pérez-Castiñeira y col 2001a; Drozdowicz y Rea 2001) .

Las H+-PPasas son proteínas de origen ancestral que conforman la clase de bombas primarias de iones más sencilla estructuralmente descrita hasta ahora, siendo in vivo proteínas homodiméricas (Maeshima 2000, Drozdowicz y Rea 2001) . La comparación de las secuencias de nucleótidos de los genes de H+-PPasas de plantas y microorganismos (bacterias, arqueas y protistas) y de sus correspondientes secuencias de aminoácidos ha mostrado un alto grado de conservación entre proteínas homólogas de todos estos organismos, evolutivamente muy alejados. Esto ha permitido definir inequívocamente a la clase o familia de proteínas denominadas "pirofosfatasas translocadoras de protones” o “H+-pirofosfatasas", a la cual se le han asignado códigos identificativos en las principales bases de datos de proteínas como Pfam (PF03030) ; InterPro (IPR004131) , o en la base de datos de Transportadores Proteínicos (TC#3.A.10) (Serrano y col. 2007) . De esta forma, cualquier secuencia proteínica que, tras ser analizada a primera vista o por métodos bioinformáticos, sea asignada a esta familia, se puede considerar con un alto grado de seguridad que corresponde a una “bona fide” H+-PPasa, y es por tanto susceptible de ser utilizada en esta invención.

El uso biotecnológico de las H+-PPasas se ha circunscrito hasta la fecha a la producción de cepas de levadura (Saccharomyces cerevisiae) o plantas transgénicas con mayor tolerancia a condiciones ambientales de estrés abiótico (salinidad, desecación) (Gaxiola y col. 1999; Gaxiola y col. 2001) . Existen varias patentes similares en relación a esta temática tecnológica, un ejemplo representativo de ellas es la siguiente:

Patent application title: Transgenic plants overexpressing a plant vacuolar Pyrophosphatase Inventors: Gerald R. Fink Roberto A. Gaxiola Seth L. Alper Agents: HAMILTON, BROOK, SMITH & REYNOLDS, P.C. Assignees: University of Connecticut Origin: CONCORD, MA US IPC8 Class: AC12N1582FI USPC Class: 800278 Patent application number: 20090288222

Sin embargo, no se ha diseñado hasta la fecha ningún procedimiento para producir células fúngicas o animales con tolerancia o resistencia a fármacos antibióticos y/o a fungicidas mediante la expresión de H+-PPasas de origen vegetal o microbiano, capaces de sustituir funcionalmente a la V-ATPasa de las endomembranas de aquellos organismos. Este problema técnico es diferente en su naturaleza a la resistencia al estrés salino o hídrico descrita en las publicaciones y patentes citadas, no resultando la combinación de sus enseñanzas en la solución técnica aportada por la presente invención.

La expresión de H+-PPasas en hongos y células animales que naturalmente no poseen esta clase de bombas de protones debe afectar a la energética celular, de forma directa a los gradientes electroquímicos de las membranas vacuolisosomales y consiguientemente al tráfico intracelular de membranas, que a su vez interesa a procesos celulares muy diversos (secreción, división celular, etc.) . De esta forma, se trata de reproducir en levadura y células animales un escenario metabólico propio de los eucariotas fotosintéticos (Pérez-Castiñeira y col. 2001;... [Seguir leyendo]

1. Uso de un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia aminoacídica de una pirofosfatasa translocadora de protones (H+-PPasa) con al menos un 30 % de identidad con las secuencias codificadas por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 para producir en células fúngicas y animales tolerancia a fármacos y antibióticos citotóxicos inhibidores de la ATPasa translocadora de H+ vacuolar 01-ATPasa) , y a fungicidas morfolinos.

2. Uso de un vector de expresión que comprende el ácido nucleico según

las reivindicación 1.

3. Uso de una célula fúngica o animal transformada o transfectada con el vector de expresión según la reivindicación 2.

4. Uso de la célula según la reivindicación 3 que comprende cualquier

producto de la expresión del ácido nucleico aislado.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el ácido nucleico aislado está unido funcionalmente a una secuencia reguladora de la expresión génica.

6. Uso según la reivindicación 5 donde la secuencia reguladora de la expresión génica es la utilizada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o cualquier otra apropiada para expresar proteínas en células fúngicas o animales.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la célula transformante es una célula fúngica.

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la célula transformante es una célula animal.

9. Una célula fúngica aislada obtenida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 conteniendo las secuencias SEO ID NO: 1, 2 ó 3, transformada o no con un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica SEO ID NO: 4 o SEO ID NO: 5, o secuencias homólogas

conteniendo otros genes IPP1 de origen fúngico.

10. Una célula animal aislada obtenida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 conteniendo las secuencias SEO ID NO: 1, 2 ó 3, transfectada o no con un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia nucleotídica de ARNi derivada de SEO ID NO: 6, o secuencias homólogas conteniendo otros genes PPA 1 de origen animal.

11. Un tejido, órgano u organismo fúngico o animal que comprende la célula según cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10.

12. Un organismo según la reivindicación 11 que pertenece a la especie

Saccharomyces cerevisiae u otra especie de hongo.

13. El organismo según la reivindicación 11 que pertenece a una especie animal, preferiblemente de mamífero.

14. Una progenie o parte del organismo que procede de cualquiera de los organismos según las reivindicaciones 11 a 13.

15. Un método para la obtención de la célula fúngica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende:

a. insertar las secuencias nucleotídicas que codifican para las proteínas codificadas por SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2 o SEO ID NO: 3 o para cualquier otra H+-PPasa natural o modificada, en un vector,

b. transformar una célula con el vector obtenido según el apartado (a)

c. Insertar en un vector las secuencias SEO ID NO: 4 o SEO ID NO: 5 o secuencias homólogas de origen fúngico, destinadas a inactivar el gen de la sPPasa citosólica IPP1 o cualquier homólogo fúngico, mediante inserción por

recombinación homóloga en la región cromosómica correspondiente

d. transformar una célula con el vector obtenido según el apartado (c) y

e. seleccionar la célula doblemente transformada según los apartados (b) y

(d) que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para las proteínas heterólogas codificadas por SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2 o SEO ID NO: 3 o para cualquier otra H+-PPasa natural o modificada, y cuyo gen IPP1 está inactivado, y que presenta resistencia a fármacos o antibióticos citotóxicos y a fungicidas.

16. El método para la obtención de la célula fúngica según la reivindicación 15, caracterizado porque las etapas de dicho método se suceden en el siguiente orden: c) , d) , a) , b) , ye) .

17. Un método para la obtención de la célula animal según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende:

a. insertar las secuencias nucleotídicas que codifican para las proteínas

codificadas por SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2 o SEO ID NO: 3 o para cualquier otra H+-PPasa natural o modificada, en un vector,

b. transfectar una célula con el vector obtenido según el apartado (a)

c. Insertar en un vector la secuencia de ARNi diseñada para el silenciamiento génico del gen de la sPPasa citosólica PPA 1 humana o

cualquier homólogo animal,

d. transfectar una célula con el vector obtenido según el apartado (c)

e. seleccionar la célula doblemente transfectada según los apartados (b) y

(d) que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para las proteínas heterólogas codificadas por SEO ID NO: 1, SEO ID NO: 2 o SEO ID NO: 3 o para cualquier otra H+-PPasa natural o modificada, y cuyo gen PPA 1 está inactivado, y que presenta resistencia a fármacos o antibióticos citotóxicos.

18. El método para la obtención de la célula animal según la reivindicación 17, caracterizado porque las etapas de dicho método se suceden en el 35 siguiente orden: c) , d) , a) , b) , ye) .

19. Un método para obtener un tejido u organismo fúngico o animal según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 que comprende: a. regenerar al menos una planta procedente de la célula obtenida según el

apartado (e) de las reivindicaciones 15 a 18,

b. seleccionar uno o varios tejidos u organismos regenerados según el apartado (a) que expresa, al menos, la secuencia nucleotídica que codifica para una H+-PPasa y tiene su gen cromosómico para la sPPasa citosólica inactivado, y

c. seleccionar uno o varios tejidos u organismos obtenidos según el apartado (b) que presentan resistencia a fármacos o antibióticos citotóxicos o a fungicidas, como se indica en reivindicaciones anteriores.

20. El método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 donde la secuencia nucleotídica que codifica para una H+-PPasa en SEO ID NO: 1, 2 o 3 o secuencias homólogas están unidas funcionalmente a una secuencia reguladora de la expresión génica.