Una nueva y eficaz diana farmacológica para el tratamiento de la tuberculosis.

Método para el cribado in vitro de fármacos candidatos para el tratamiento de la tuberculosis por interferencia con la biosíntesis de arabinogalactano,

en que dicho método comprende una etapa de puesta en contacto de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa en exceso una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa y que está codificada por el gen rv3790 u homólogos del mismo o cualquier marco de lectura abierto artificial cuyo producto génico sea idéntico u homólogo a la proteína Rv3790 con un fármaco candidato y la posterior evaluación del porcentaje de inhibición causado por el fármaco candidato frente a un control en una prueba de ensayo.

Una nueva y eficaz diana farmacológica para el tratamiento de la tuberculosis.

Campo de la invención La presente invención permite un método de cribado para la identificación de nuevos fármacos para el tratamiento de la tuberculosis, así como un método de diagnóstico para identificar cepas clínicas resistentes a estos nuevos fármacos.

Técnica anterior

La tuberculosis (TB) sigue siendo la principal causa de mortalidad debida a un solo agente infeccioso, Mycobacterium tuberculosis. Este patógeno ha infectado latentemente a un tercio de la población mundial. Actualmente, la quimioterapia para la TB se compone de un cóctel de fármacos de primera y segunda línea. El tratamiento actual de la TB requiere de seis a nueve meses, lo que conlleva una toxicidad significativa, así como resistencia a los fármacos. Desde el momento de la introducción de los fármacos contra la TB, se han encontrado frecuentemente cepas de M. tuberculosis resistentes a los mismos. De hecho, las micobacterias presentan resistencia natural frente a la mayoría de los antibióticos de uso común, debido a su poco corriente pared celular. Además, se consideran cambios genéticos responsables de la resistencia adquirida a los fármacos. Las cepas de M. tuberculosis resistentes a un número creciente de fármacos de segunda línea usados para el tratamiento de la tuberculosis resistente a múltiples fármacos (MDR-TB) se están convirtiendo en una amenaza para la salud pública mundial (1) . En consecuencia, existe una necesidad urgente de nuevos fármacos para el tratamiento de la tuberculosis. En particular, se necesitan nuevos fármacos con nuevos mecanismos de acción que sean activos contra cepas resistentes a los fármacos. Por consiguiente, también existe una necesidad acuciante de identificar nuevas dianas farmacológicas (2) . El documento WO 2007/134625 desvela derivados de benzotiazina y su uso como agentes antibacterianos en enfermedades infecciosas causadas por bacterias, especialmente tuberculosis (TB) y lepra, causadas por micobacterias.

Brennan, Patrick J. y col. desvelan el núcleo de la pared celular de M. tuberculosis en el contexto del descubrimiento de fármacos, así como la ruta de biosíntesis del arabinogalactano micobacteriano.

El documento US 2002/151008 A1 describe un método de cribado para la identificación de fármacos contra M. tuberculosis que implica el uso del gen iniB como diana para el cribado.

El documento WO 01/35317 desvela una proteína idéntica a Rv3790 como potencial diana farmacológica en M. tuberculosis.

El documento US 2003/013090 A1 desvela un método de cribado para identificar si un paciente es portador de una cepa de M. tuberculosis resistente a etionamida mediante la determinación de la presencia de una mutación en el gen etaA.

Seidel Mathias y col. describen una nueva arabinofuranosil-transferasa AftB implicada en una etapa terminal de la biosíntesis del arabinano de la pared celular en M. tuberculosis.

Alderwick, Luke J. y col., desvelan la transferasa AftA que también podría representar una diana farmacológica atractiva.

Sumario de la invención La presente invención se basa en el descubrimiento de que la proteína Rv3790 de Mycobacterium tuberculosis, cuya secuencia de ADN puede obtenerse en http://genolist.pasteur.fr/TubercuList (TubercuList WorldWide Web Server; coordenadas del gen de Rv3790: de 4162306 a 4163718) , es la diana para fármacos de benzotiazinona, una nueva clase de moléculas que parecen ser muy prometedoras en el tratamiento de la tuberculosis ("New thiazinone derivatives, their preparations and their use as antibacterials", solicitud de patente n° PCT/EP 2006/004942, a nombre del Instituto Leibniz para la Investigación de Productos Naturales y la Biología de la Infección, e. V., Instituto Hans Knöll (HKI) .

Se ha demostrado que las proteínas Rv3790 y Rv3791 trabajan concertadamente y están implicadas en la biosíntesis de arabinogalactano (3) . El arabinogalactano es un componente fundamental de la pared celular micobacteriana que une covalentemente la capa exterior de ácidos micólicos al peptidoglucano. En particular, ambas proteínas Rv3790 y Rv3791 son importantes para llevar a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa (3) . El descubrimiento sugiere que los fármacos de benzotiazinona interfieren con la biosíntesis de la pared celular micobacteriana. Es de señalar que ambos genes rv3790 y rv3791 han sido descritos como esenciales por mutagénesis con el transposón Himar-1 en la cepa H37Rv (4) .

Hemos encontrado que mutaciones en el extremo C de la proteína Rv3790, así como su expresión en exceso confieren un alto grado de resistencia a fármacos derivados de benzotiazinona en Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis BCG y Mycobacterium smegmatis. Los genes rv3790 naturales y mutados, así como rv3791 han sido clonados y expresados en exceso en Escherichia coli.

Se han encontrado proteínas ortólogas de Rv3790 sensibles a los derivados de benzotiazinona en los géneros siguientes: Nocardia, Rhodococcus y Cor y nebacterium.

Puede formularse la hipótesis de que los excelentes resultados obtenidos en la evaluación de laboratorio con los derivados de benzotiazinona se correlacionan con la acción inhibitoria de Rv3790 que se ha descubierto. Esta evidencia puede poner en marcha nuevas investigaciones sobre fármacos que actúen contra la proteína Rv3790. Por lo tanto, la proteína Rv3790 y proteínas homólogas relacionadas y especialmente ortólogas no solo son dianas óptimas para fármacos pertenecientes a la clase de las benzotiazinonas, sino también prometedoras dianas para el descubrimiento de nuevos fármacos para utilizar en la lucha contra infecciones causadas por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Nocardia, Rhodococcus y Cor y nebacterium.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para el cribado de fármacos candidatos para el tratamiento de la tuberculosis por interferencia con la biosíntesis de arabinogalactano, en que dicho método comprende una etapa de puesta en contacto de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa en exceso una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-Parabinosa y que está codificada por el gen rv3790 u homólogos del mismo o cualquier marco de lectura abierto artificial cuyo producto génico sea idéntico u homólogo a la proteína Rv3790 con un fármaco candidato y la posterior evaluación del porcentaje de inhibición causado por el fármaco candidato frente a un control (M. tuberculosis transformado solo con el vector pSODIT-2) en una prueba de ensayo.

Preferentemente, la prueba de ensayo es una prueba de ensayo in vitro de la actividad antibacteriana o una prueba enzimática.

Otro objeto de la presente invención es una preparación de un cultivo celular de cepas mutantes de Mycobacterium tuberculosis con el aminoácido cisteína de la posición 387 sustituido por una serina o una glicina para uso como herramienta de control en el método de la presente invención.

El descubrimiento de que proteínas del tipo de Rv3790 codificadas por genes mutados son responsables de la resistencia a los fármacos que interfieren con la biosíntesis de arabinogalactano, como los fármacos de benzotiazinona, tendrá importantes implicaciones en el diagnóstico y el tratamiento de cepas micobacterianas resistentes a los fármacos.

Por lo tanto, otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico rápido de cepas micobacterianas resistentes a los fármacos que implica la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (5) de una región interna que solapa con el codón 387 del gen rv3790 de una cepa de Mycobacterium tuberculosis aislada de un paciente de TB y el análisis de la secuencia de ADN para detectar la presencia de las mutaciones identificadas como responsables de la resistencia a los fármacos que interfieren con la biosíntesis de arabinogalactano, como las benzotiazinonas.

En el contexto de la presente invención, el término "fármaco que interfiere con la biosíntesis de arabinogalactano"

indica una molécula que impide la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa al bloquear o silenciar una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa y que está codificada por el gen rv3790 u homólogos del mismo o por cualquier marco de lectura abierto artificial cuyo producto génico es idéntico u homólogo a la proteína Rv3790.

Otro objeto de la presente invención son inhibidores de la proteína Rv3790 obtenidos por el método de cribado de la invención... [Seguir leyendo]

1. Método para el cribado in vitro de fármacos candidatos para el tratamiento de la tuberculosis por interferencia con la biosíntesis de arabinogalactano, en que dicho método comprende una etapa de puesta en contacto de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa en exceso una proteína que lleva a cabo la transformación de decaprenil-P-ribosa en decaprenil-P-arabinosa y que está codificada por el gen rv3790 u homólogos del mismo o cualquier marco de lectura abierto artificial cuyo producto génico sea idéntico u homólogo a la proteína Rv3790 con un fármaco candidato y la posterior evaluación del porcentaje de inhibición causado por el fármaco candidato frente a un control en una prueba de ensayo.

2. Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha prueba de ensayo es una prueba antibacteriana in vitro o una prueba enzimática.

3. Método de cribado de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa Rv3790 en exceso se obtiene por transformación de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis con pSODIT-2/Rv3790.

4. Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la evaluación del porcentaje de inhibición se realiza mediante la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) del fármaco candidato.

5. Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se usan dos o más concentraciones de los fármacos con el fin de calcular dicha CIM para cada fármaco candidato.

6. Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que cada fármaco candidato se prueba también en un cultivo celular de M. tuberculosis transformado solo con el vector pSODIT-2.

7. Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que dicho control es isoniazida.

8. Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se lleva a cabo un experimento de control adicional en que no se administra ningún tratamiento con un fármaco candidato de modo que se tiene un 0% de inhibición y en el que el % de inhibición obtenido con el fármaco candidato se evalúa con respecto a tal control adicional.

9. Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha etapa de puesta en contacto de un cultivo celular de Mycobacterium tuberculosis que expresa Rv3790 en exceso con un fármaco candidato puede llevarse a cabo por siembra en placa de la preparación celular en un medio adecuado que contiene diferentes concentraciones del fármaco candidato.

10. Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho medio es el medio sólido Middlebrook 7H11 (proveedor Difco) .

11. Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho medio se suministra con ácido oleico, albúmina de suero bovino, dextrosa y catalasa (OADC) .

12. Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicha prueba de ensayo es una prueba enzimática que comprende una etapa de puesta en contacto de un fármaco candidato con una enzima Rv3790 recombinante en una mezcla de reacción que contiene FAD, NAD+, NADPH y decaprenilfosforilrribosa (DPR) radiomarcada y la posterior evaluación, frente a un control, del porcentaje de inhibición de la reacción enzimática para obtener decaprenilfosforil-D-Araf (DPA) causado por el fármaco candidato.

13. Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además una evaluación por cribado in vivo de los fármacos candidatos que pasan la prueba in vitro, en que dicha evaluación in vivo comprende la administración de regímenes de dosificación preseleccionados del fármaco candidato a ratones con diseminación hemática de una cepa de tuberculosis, en comparación con un fármaco de control y con un placebo.

14. Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el fármaco de control es isoniazida.

15. Método de cribado de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, en el que se usan ratones BALB/C.

16. Método de cribado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la cepa de tuberculosis es un cultivo virulento de Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

17. Método de diagnóstico para la identificación de cepas micobacterianas resistentes a los fármacos en un

paciente, en que el método implica la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa del gen rv3790 de una cepa de Mycobacterium tuberculosis aislada de un paciente de TB y el análisis de la secuencia de ADN para detectar la presencia de un cambio de cisteína a glicina o de cisteína a serina en el codón 387 como responsable de la resistencia a las benzotiazinonas.

18. Fármacos inhibidores de la proteína Rv3790 que pueden obtenerse por el método de cribado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en los que dichos fármacos inhibidores se seleccionan entre anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína Rv3790 y secuencias no codificantes de ARN del gen rv3790.

19. Inhibidores de acuerdo con la reivindicación 18, en los que dichos inhibidores son secuencias no codificantes de ARN que pueden obtenerse a partir de una secuencia d.

2. mer de la secuencia de ARNm del gen rv3790.

20. Inhibidores de acuerdo con la reivindicación 19, en los que dicha secuencia es SEQ ID NO. 1: AUG UUG AGC

GUG GGA GCU ACC ACU A. 15

21. Preparación de cultivos celulares de cepas mutantes de Mycobacterium tuberculosis con el aminoácido cisteína de la posición 387 del gen rv3790 sustituido por serina o glicina como herramienta de control.

22. Uso de SEQ ID NO. 1: AUG UUG AGC GUG GGA GCU ACC ACU A para la preparación de un medicamento 20 para el tratamiento de la tuberculosis.