Un método de mutagénesis mejorada utilizando polietilenglicol por introducción de bases nitrogenadas mutagénicas en protoplastos vegetales.

Procedimiento para la alteración dirigida de una secuencia bicatenaria de ADN aceptor en un protoplasto deuna célula vegetal,

que comprende la combinación de la secuencia bicatenaria de ADN aceptor con una basenitrogenada mutágena dadora, comprendiendo la secuencia bicatenaria de ADN aceptor una primerasecuencia de ADN y un segunda secuencia de ADN que es complementaria de la primera secuencia de ADN ycomprendiendo la base nitrogenada mutágena dadora por lo menos un emparejamiento incorrecto conrespecto a la secuencia bicatenaria de ADN aceptor a alterar, preferentemente con respecto a la primerasecuencia de ADN, comprendiendo el procedimiento además una etapa de introducción de la base nitrogenadamutágena en los protoplastos celulares utilizando una transformación con polietilenglicol (PEG).

Método de mutagénesis mejorada utilizando polietilenglicol por introducción de bases nitrogenadas mutagénicas en protoplastos vegetales.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un proceso de mutagénesis dirigida mediante la introducción de una base nitrogenada mutágena en protoplastos vegetales utilizando polietilenglicol (PEG) . La presente invención se refiere asimismo a la utilización del PEG para mejorar la mutagénesis dirigida.

Antecedentes de la invención El proceso de crear deliberadamente cambios en el material genético de células vivas tiene como objetivo modificar una o más propiedades biológicas codificadas genéticamente de dicha célula o del organismo de la que forma parte la célula o en el que se puede regenerar. Dichos cambios pueden tomar la forma de deleción de partes del material genético, adición de material genético exógeno o cambios en la secuencia de nucleótidos existente del material genético. Los métodos para alterar el material genético de los organismos eucariotas se conocen desde hace más de 20 años y han encontrado una amplia aplicación en las células vegetales, humanas y animales y en los microorganismos para introducir mejoras en los campos de la agricultura, la salud, la calidad de los alimentos y la protección medioambiental. Los métodos más comunes comprenden la adición de fragmentos de ADN exógeno al genoma celular, que a su vez confieren una nueva propiedad a dicha célula o a su organismo además de las propiedades codificadas por genes ya existentes (incluyendo aplicaciones en las que la expresión de los genes existentes se verá de este modo suprimida) . Aunque muchos de estos ejemplos son eficaces en la obtención de las propiedades pretendidas, dichos métodos no son, sin embargo, muy precisos, ya que no existe control sobre las posiciones genómicas en las que se insertan los fragmentos de ADN exógenos (y por lo tanto en los niveles últimos de expresión) y porque el efecto pretendido deberá manifestarse por sí mismo en las propiedades naturales codificadas por el genoma original y bien equilibrado. En cambio, los procedimientos de mutagénesis dirigida, con los que se obtendrá la adición, deleción o conversión de nucleótidos en locus genómicos predefinidos, permitirán la modificación precisa de los genes existentes. Además, debido a la naturaleza precisa de la mutagénesis dirigida, su se espera que las nuevas estirpes vegetales obtenidas de este modo sean aceptadas más fácilmente por los consumidores.

La mutagénesis dirigida es un procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio que se basa en introducir en el núcleo de la célula eucariota bases nitrogenadas sintéticas mutágenas (moléculas que consisten en tramos cortos de regiones parecidas a nucleótidos que se parecen al ADN en lo que se refiere a sus propiedades de apareamiento de bases de Watson y Crick, pero que pueden ser químicamente distintas del ADN) (Alexeev and Yoon, NatureBiotechnol. 16: 1343, 1998; Rice, NatureBiotechnol. 19: 321, 2001; Kmiec, J. Clin. Invest. 112: 632, 2003) . Una vez introducidas en la célula, dichas bases nitrogenadas mutágenas se aparean con la secuencia complementaria en el locus de actuación. Al diseñar deliberadamente un emparejamiento incorrecto de la base nitrogenada, el emparejamiento incorrecto puede provocar la conversión de un nucleótido de la posición correspondiente en la secuencia genómica de actuación. Dicho procedimiento permite la conversión de un solo o, como máximo, unos pocos nucleótidos en locus endógenos, pero se puede aplicar para crear codones de terminación en los locus existentes, obteniéndose una perturbación de su función, o para crear cambios en los codones, obteniéndose genes que codifican proteínas con una composición de aminoácidos alterada (ingeniería de proteínas) .

La mutagénesis dirigida se ha descrito en células vegetales, animales y de levaduras. Se han utilizado dos clases distintas de bases nitrogenadas mutágenas sintéticas en dichos estudios, bases nitrogenadas de ADN: ARN quimérico o bases nitrogenadas monocatenarias.

Las bases nitrogenadas de ADN: ARN quimérico (quimeras) son moléculas auto complementarias que comprenden una única región de ADN de 25 pb y una secuencia complementaria de 25 pb constituida por 5 pb de la región central de ADN flanqueada en ambos lados por 10 pb de ARN 2'-O-metilado que se considera que contribuye a la estabilidad de la quimera en la célula. La región central de 5 pb comprende en su centro un emparejamiento incorrecto genomanipulado con el nucleótido a alterar en la secuencia del ADN genómico de actuación. Ambas regiones se encuentran unidas por horquillas de timidina de 4 pb. Se considera que al introducir la quimera en la célula forma un asa D doble con su secuencia de acceso y se forma un emparejamiento incorrecto entre la quimera y el nucleótido de actuación. Dicho emparejamiento incorrecto lo resuelven a continuación las proteínas de reparación del ADN celular endógenas mediante la conversión del nucleótido genómico. Los primeros ejemplos de mutagénesis dirigida utilizando quimeras se obtuvieron en células animales (revisado Igouchevaet al. 2001 Gene Therapy 8, 391-399) y se utilizaron asimismo posteriormente para obtener una mutagénesis dirigida en células vegetales (Beethamet al. 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8774-8778; Zhu et al. 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8768-8773; Zhu et al. 2000 NatureBiotech. 18, 555-558; Kochevenkoet al. 2003 PlantPhys. 132: 174-184; Okuzakiet al. 2004 PlantCell Rep. 22: 509-512) . A diferencia de las células humanas, una célula vegetal en la que se ha producido una mutagénesis dirigida se puede regenerar en una planta intacta y transferir la mutación a la generación siguiente, por lo que es una herramienta ideal tanto para la investigación como para la mutagénesis comercial de cultivos alimentarios importantes. Sin embargo, una amplia investigación realizada por muchos laboratorios ha demostrado que la frecuencia de la mutagénesis dirigida utilizando quimeras es bastante baja y variable, o incluso inapreciable (Ruiteret al. 2003 Plant Mol. Biol. 53, 715-729, Van der Steegeet al. (2001) NatureBiotech. 19: 305-306) , y que depende de factores tales como el estado transcripcional del objetivo, el estado de la célula en el ciclo celular, la secuencia del objetivo y la calidad de las quimeras, que resultan difíciles de sintetizar. Debido a la frecuencia relativamente baja de mutagénesis dirigida con los métodos conocidos en la técnica, dichos eventos se pueden detectar únicamente cuando la alteración de un solo nucleótido del objetivo genómico tiene como resultado un fenotipo dominante que se pueda seleccionar. Se introdujeron en células vegetales mutaciones puntuales específicas en el marco de lectura abierto del gen de la acetolactatosintasa (ALS, en el AHAS de maíz) que cataliza la etapa inicial común de la síntesis de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina y valina. En el tabaco, las alteraciones de nucleótidos individuales resultan suficientes para producir las conversiones de los codones P194Q o W571 L. La proteína ALS producida tras cualquiera de dichas conversiones de codones es insensible a la inhibición mediante la clase de herbicidas de las sulfonilureas, proporcionando de este modo un procedimiento de selección para las conversiones de un solo nucleótido en un locus cromosómico.

Debido a las dificultades de trabajar con quimeras, se han buscado diseños de oligonucleótidos alternativos más fiables. Diversos laboratorios han investigado la capacidad de las bases nitrogenadas monocatenarias (ss) para realizar la mutagénesis dirigida. Se ha descubierto que estas permiten obtener unos resultados más reproducibles, son más fáciles de sintetizar y pueden comprender asimismo nucleótidos modificados para mejorar el rendimiento de la base nitrogenada mutágena en la célula (Liuet al. 2002 Nucl. Acids Res. 30: 2742-2750; revisión, Parekh-Olmedo et al. 2005 Gene Therapy 12: 639-646; Dong et al. 2006PlantCell Rep. 25. 457-65; De Piedoueet al. 2007 Oligonucleotides 27: 258-263) .

La mutagénesis dirigida se ha descrito en diversas de solicitudes de patente a nombre de Kmiec, entre otros, en los documentos WO0173002, WO03/027265, WO01/87914, WO99/58702, WO97/48714, WO02/10364. En el documento WO 01/73002 se describe que se considera ampliamente que la baja eficiencia de la alteración genética obtenida utilizando bases nitrogenadas sin modificar se debe a su degradación por las nucleasas presentes en la mezcla de la reacción o en la célula elegida como objetivo. Para solucionar dicho problema, se propone incorporar nucleótidos modificados que provocan que las bases nitrogenadas resultantes sean resistentes a las nucleasas. Los ejemplos típicos... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la alteración dirigida de una secuencia bicatenaria de ADN aceptor en un protoplasto de una célula vegetal, que comprende la combinación de la secuencia bicatenaria de ADN aceptor con una base 5 nitrogenada mutágena dadora, comprendiendo la secuencia bicatenaria de ADN aceptor una primera secuencia de ADN y un segunda secuencia de ADN que es complementaria de la primera secuencia de ADN y comprendiendo la base nitrogenada mutágena dadora por lo menos un emparejamiento incorrecto con respecto a la secuencia bicatenaria de ADN aceptor a alterar, preferentemente con respecto a la primera secuencia de ADN, comprendiendo el procedimiento además una etapa de introducción de la base nitrogenada mutágena en los protoplastos celulares utilizando una transformación con polietilenglicol (PEG) .

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la base nitrogenada mutágena monocatenaria presenta una longitud comprendida entre 10 y 60 nucleótidos.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la base nitrogenada mutágena monocatenaria comprende sustituciones de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) que son por lo menos un nucleótido eliminado del emparejamiento incorrecto dirigido y, opcionalmente, por lo menos 3, 4 o 5 nucleótidos eliminados de los extremos 5' y 3' de la base nitrogenada mutágena monocatenaria.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la base nitrogenada mutágena monocatenaria comprende sustituciones de propino.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN aceptor procede de ADN genómico, ADN lineal, cromosomas artificiales de mamíferos, cromosomas artificiales bacterianos,

cromosomas artificiales de levaduras, cromosomas artificiales vegetales, ADN cromosómico nuclear, ADN cromosómico de orgánulos, ADN episómico.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para alterar una célula, corregir una mutación restaurando el tipo natural, introducir una mutación, inactivar un enzima disgregando la región de codificación, modificar la bioactividad de un enzima alterando la región de codificación o modificar una proteína disgregando la región de codificación.

7. Utilización de la transformación con PEG para aumentar la eficiencia de la mutagénesis dirigida utilizando una base nitrogenada mutágena monocatenaria en protoplastos vegetales en por lo menos 10 veces en 35 comparación con la transformación basada en la electroporación.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que la base nitrogenada mutágena monocatenaria presenta una longitud comprendida entre 10 y 60.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en la que la base nitrogenada mutágena monocatenaria comprende sustituciones de LNA que son por lo menos un nucleótido eliminado del emparejamiento incorrecto dirigido y, opcionalmente, por lo menos 3, 4 o 5 nucleótidos eliminados de los extremos 5' y 3' del oligonucleótido.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que la base nitrogenada mutágena monocatenaria comprende sustituciones de propino.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN aceptor procede de ADN genómico, ADN lineal, cromosomas artificiales de mamíferos, cromosomas artificiales bacterianos,

cromosomas artificiales de levaduras, cromosomas artificiales vegetales, ADN cromosómico nuclear, ADN cromosómico de orgánulos, ADN episómico.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para alterar una célula, corregir una mutación restaurando el tipo natural, introducir una mutación, inactivar un enzima disgregando la región de codificación,

modificar la bioactividad de un enzima alterando la región de codificación o modificar una proteína disgregando la región de codificación.