Tribonectinas.

Una tribonectina que contiene una secuencia de aminoácidos que abarca por lo menos una,

pero menos de 76 subunidades, en la que

(a) cada subunidad consta por lo menos de 7 aminoácidos;

(b) la secuencia de aminoácidos de dicha subunidad es idéntica por lo menos en un 50% con la SEQ ID NO: 3, en la que un aminoácido no idéntico es una sustitución conservadora de aminoácido;

(c) dicha tribonectina consta por lo menos de un resto ß(1-3)Gal-GalNAc; y

(d) por lo menos un 10% en peso de dicha tribonectina está formado por oligosacáridos unidos a través de O.

Tribonectinas.

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/298, 970, depositada el 23 de abril de 1999, cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia.

Antecedentes de la invención La invención se refiere a la lubricación de articulaciones de mamíferos.

La osteoartritis (OA) es una de las formas más frecuentes de artropatías. Los factores que contribuyen al desarrollo de la OA incluyen un historial familiar de OA, daño previo de la articulación por lesión o cirugía y edad de la articulación, es decir, el "desgaste y deterioro" de las superficies que forman la articulación. La OA es muy frecuente en grupos de personas mayores, pero también puede afectar a los niños.

El tratamiento actual está destinado a aliviar el dolor y otros síntomas de la OA, por ejemplo, mediante la administración de fármacos analgésicos y anti-inflamatorios. Otras propuestas terapéuticas incluyen la viscosuplementación mediante la administración de ácido hialurónico y sus derivados al tejido articular para aumentar la viscosidad del líquido sinovial.

Sumario de la invención La invención se refiere a un nuevo tratamiento de la osteoartritis y otras enfermedades degenerativas de las articulaciones mediante la tribosuplementación. La tribosuplementación se realiza administrando directamente polipéptidos lubricantes a la articulación lesionada o artrítica. A diferencia de la viscosuplementación, la tribosuplementación no aumenta sustancialmente la viscosidad de la solución, por ejemplo, del líquido sinovial, a la que se añade. La viscosidad de una solución a la que se añade una tribonectina aumenta como máximo 10%, preferiblemente como máximo 5%, más preferiblemente como máximo 2%, más preferiblemente como máximo 1%. Lo más preferiblemente, la viscosidad de la solución a la que se añade una tribonectina permanece invariable o disminuye.

Por consiguiente, la invención proporciona una tribonectina. Una tribonectina es un lubricante artificial por capa límite, que contiene al menos una repetición de una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en al menos 50% a KEPAPTT (SEQ ID NO: 3) . La invención proporciona una tribonectina que contiene al menos un resto lubricante unido por O, en donde dicho resto lubricante es un resto º (1-3) Gal-GalNAc. La secuencia de aminoácidos de la cadena principal de la proteína de una tribonectina de origen natural puede ser diferente en función del empalme alternativo de exones del gen del factor estimulante de megacariocitos (MSF) humano. Por ejemplo, la tribonectina contiene los aminoácidos 1 a 24 y 200 a 1404 de la SEQ ID NO: 1, pero carece de los aminoácidos 25-199 de la SEQ ID NO: 1. La tribonectina contiene los aminoácidos 1 a 156 y 200 a 1404 de la SEQ ID NO: 1, pero carece de los aminoácidos 157 a 199 de la SEQ ID NO: 1. La tribonectina contiene los aminoácidos 1 a 106 de la SEQ ID NO: 1 y 200 a 1404 de la SEQ ID NO: 1, pero carece de los aminoácidos 107 a 199 de la SEQ ID NO: 1. La tribonectina contiene los aminoácidos 1 a 25 de la SEQ ID NO: 1, 67 a 106 de la SEQ ID NO: 1 y 200 a 1404 de la SEQ ID NO: 1, pero carece de los aminoácidos 26 a 66 de la SEQ ID NO: 1. Las tribonectinas son polipéptidos de origen natural purificados o polipéptidos sintéticos o recombinantes. La secuencia de aminoácidos de la cadena principal de las tribonectinas sintéticas o recombinantes es idéntica en al menos 50% a la secuencia de aminoácidos de una tribonectina de origen natural y posee al menos 50% de la actividad lubricante de una tribonectina de origen natural.

Una tribonectina se formula para la administración a una articulación u otro tejido de mamífero, por ejemplo, tejido cardíaco, cuya lubricación se desea. Preferiblemente, la tribonectina es un polipéptido lubricante recombinante o sintetizado químicamente. Por ejemplo, una tribonectina incluye un polipéptido sustancialmente puro, cuya secuencia de aminoácidos incluye al menos repeticiones, pero menos de 76 repeticiones. Cada subunidad contiene al menos 7 aminoácidos (y típicamente 10 o menos aminoácidos) . La secuencia de aminoácidos de cada subunidad es idéntica en al menos 50% a la SEQ ID NO: 3 y un aminoácido no idéntico de la secuencia de referencia es una sustitución conservadora de aminoácido. Por ejemplo, uno o los dos residuos de treonina están sustituidos por un residuo de serina. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la subunidad es idéntica a la SEQ ID NO: 3. La tribonectina puede contener además una o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos XXTTTX (SEQ ID NO: 4) . Los polipéptidos u otros compuestos descritos en la presente memoria se dice que son "sustancialmente puros" si dentro de las preparaciones el compuesto de interés está presente en al menos 60% en peso (peso en seco) . Preferiblemente, la preparación contiene al menos 75%, más preferiblemente al menos 90% y los más preferiblemente al menos 99%, en peso del compuesto de interés. La pureza puede medirse por cualquier método apropiado, por ejemplo, por cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis por HPLC.

Cuando se dice que un polipéptido o molécula de ácido nucleico concretos tienen una identidad porcentual específica a un polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia, de una longitud definida, la identidad porcentual se refiere al polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia. Por tanto, un péptido que es idéntico en 50% a un polipéptido de referencia que tiene una longitud de 100 aminoácidos puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es completamente idéntico a una porción de una longitud de 50 aminoácidos del polipéptido de referencia. Puede ser también un polipéptido de 100 aminoácidos que es idéntico en 50% al polipéptido de referencia tomando en consideración toda su longitud.

Un polipéptido o molécula de ácido nucleico que es "sustancialmente idéntico" a un polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia dado es un polipéptido o molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 85%, preferiblemente en 90% y más preferiblemente en 95%, 98%, 99% o más a la secuencia del polipéptido o de la molécula de ácido nucleico de referencia. La "identidad" tiene un significado reconocido en la técnica y se calcula usando métodos publicados, bien conocidos, por ejemplo, Computational Molecular Biology, 1988, Lesk A.M., ed., Oxford University Press, New York; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, 1993, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, 1994, Griffin, A.M. and Griffin, E.G., ed., Humana Press, New Jersey; Sequence Analysis in Molecular Biology, 1987, Heinje, G., Academic Press, New York; y Sequence Analysis Primer, 1991, Gribskov, M. and Devereux, J., ed., Stockton Press, New York. Existen, pues, muchos métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos y el término "identidad" es conocido por los expertos y tiene un significado definido con relación al método especificado determinado. La identidad de secuencias descrita en la presente memoria se mide con el programa informático Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI) . Se emplea el módulo MegAlign del método Clustal V (Higgins et al., CABIOS 5 (2) , 151-3, 1989) . Los parámetros empleados son: penalización de hueco = 10, penalización de longitud de hueco = 10.

Alternativamente, los ácido nucleicos que difieren de una secuencia de referencia dada se hibridan con alta rigurosidad a una cadena de DNA que tiene la secuencia de referencia o uno de sus complementos. Las condiciones de alta rigurosidad son la hibridación a 42 grados C en formamida del 50%, un primer lavado a 65 grados C con 2 X SSC y un segundo lavado a 65 grados C con 0, 2 X SSC.

Una tribonectina se caracteriza por reducir el coeficiente de fricción (or ejemplo, la entre superficies de apoyo. P reducción de la fricción se mide in vitro detectando una reducción de la fricción en un aparato que emplea apoyos de látex:vidrio. La reducción de fricción se mide también in vivo, por ejemplo, midiendo la reducción del dolor del paciente. Las tribonectinas de la invención son composiciones lubricantes. Se analiza la función lubricante de los polipéptidos que tienen una identidad de al menos 50% (pero menos del 100%) de secuencias de aminoácidos a una secuencia de referencia, midiendo la reducción del 1 entre las superficies de apoyo.

Una tribonectina de la invención incluye un oligosacárido unido por O y comprende N-acetilgalactosamina y galactosa en la forma beta (1-3) Gal-GalNAC. Por ejemplo, los dominios repetitivos KEPAPTT (SEQ ID NO: 3) y XXTTTX... [Seguir leyendo]

1. Una tribonectina que reduce el coeficiente de fricción entre superficies de apoyo, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una, pero menos de 76, subunidades, en donde:

(a) cada subunidad comprende al menos 7 aminoácidos;

(b) la secuencia de aminoácidos de dicha al menos una subunidad es la SEQ ID NO: 3; y

(c) en donde al menos 10% en peso de dicha tribonectina está glicosilada por º (1-3) Gal-GalNAc unido por O; para uso en un método para lubricar tejido en un mamífero.

2. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende además una o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

3. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende los aminoácidos 1-24 .

20. 1404 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha tribonectina carece de los aminoácido.

2. 199 de la SEQ ID NO: 1.

4. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende los aminoácidos 1-156 .

20. 1404 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha tribonectina carece de los aminoácido.

15. 199 de la SEQ ID NO: 1.

5. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende los aminoácidos 1-106 de la SEQ ID NO: 1 .

20. 1404 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha tribonectina carece de los aminoácido.

10. 199 de la SEQ ID NO: 1.

6. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende los aminoácidos 1-25 de la SEQ ID NO: 1.

6. 106 de la SEQ ID NO: 1 .

20. 1404 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha tribonectina carece de los aminoácido.

2. 66 de la SEQ ID NO: 1.

7. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina se caracteriza porque reduce el coeficiente de fricción entre las superficies de apoyo in vitro.

8. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina se caracteriza porque reduce el coeficiente de fricción entre las superficies de apoyo in vivo.

9. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina no aumenta sustancialmente la viscosidad de una solución a la que se añade.

10. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde al menos 20% de dicha tribonectina está glicosilado por dicho resto oligosacárido unido por O.

11. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde al menos 40% de dicha tribonectina está glicosilado por dicho resto oligosacárido unido por O.

12. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde el peso molecular de dicha tribonectina está en el intervalo d.

22. 280 kDa.

13. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende un fragmento de factor estimulante de megacariocitos.

14. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuo.

20. 1140, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.

15. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuo.

20. 1167, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.

16. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuo.

20. 1212, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.

17. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuo.

20. 1263, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.

18. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina carece de la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-24, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.

19. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina carece de la secuencia de aminoácidos de los residuo.

6. 104, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.

20. El uso de la tribonectina definida en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para lubricar una articulación de un mamífero.

21. El uso de la reivindicación 20, en donde dicha articulación es una articulación de un ser humano.

22. El uso de la reivindicación 20, en donde dicha articulación es una articulación de un perro.

23. El uso de la reivindicación 20, en donde dicha articulación es una articulación de un caballo.

24. El uso de la reivindicación 20, en donde dicho medicamento se administra por vía intra-articular.

25. El uso de una tribonectina definida en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar el síndrome de camptodactilia-artropatía-pericarditis en un mamífero.

26. Una composición biocompatible que comprende la tribonectina definida en la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende además ácido hialurónico reticulado o no reticulado.

27. Una composición biocompatible que comprende la tribonectina definida en la reivindicación 1, en donde dicha composición está en una forma adecuada para la inhibición de la formación de adhesión a tejidos y está en forma de una membrana, una espuma, un gel o una fibra.

28. El uso de una tribonectina definida en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para inhibir la formación de adhesión entre una primera superficie y una segunda superficie de un mamífero.

29. El uso de la reivindicación 28, en donde dicha primera superficie y dicha segunda superficie son, ambas, tejidos lesionados de dicho mamífero.

30. El uso de la reivindicación 28, en donde dicha primera superficie o dicha segunda superficie es un dispositivo artificial.

31. El uso de la reivindicación 30, en donde dicho dispositivo artificial es un implante ortopédico.

32. El uso de la reivindicación 28, en donde dicho medicamento está en forma de una membrana, una espuma, un gel o una fibra.

33. El uso de la reivindicación 28, en donde dicha lesión se debe a una incisión quirúrgica.

34. El uso de la reivindicación 28, en donde dicha lesión se debe a un traumatismo.

35. El uso de la reivindicación 28, en donde dicha primera superficie o dicha segunda superficie es el tejido pericárdico.

36. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende además un grupo protector NeuAc.

37. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende un polipéptido recombinante.

38. La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende un polipéptido sintetizado químicamente