Proteínas Wnt y detección y tratamiento de cáncer.

Un método para identificar un agente anti-cáncer de hígado, comprendiendo el método:

seleccionar un compuesto de ensayo que se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidosde una proteína Wnt3 o Wnt11 o un fragmento de unión a FZD de la misma; y

determinar si el compuesto de ensayo es capaz de:

(a) reducir la señalización de Wnt/FZD 7 en una célula de hígado;

(b) reducir la motilidad de células de cáncer de hígado;(c) reducir la acumulación de β-catenina en una célula de cáncer

de hígado; o

(d) tratar el cáncer de hígado in vitro o en un animal no humano in vivo;

en el que un compuesto de ensayo que es capaz de al menos uno de (a) a (d) es un agente anti-cáncer de hígado.

Proteínas Wnt y detección y tratamiento de cáncer

Declaración con respecto a investigación patrocinada federalmente [0001] La presente invención se realizó con el apoyo del Gobierno bajo las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud Nº CA035711 y AA002666. El Gobierno tiene algunos derechos en la presente invención.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas [0002] La presente solicitud es una continuación en parte de la Solicitud Internacional Nº PCT/US05/000267, presentada el 5 de enero de 2005, que reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/612.098, presentada el 21 de septiembre de 2004.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la detección y el tratamiento de cáncer de hígado.

Antecedentes [0004] El carcinoma hepatocelular (HCC) es el principal tumor maligno primario del hígado. Aunque se han identificado factores etiológicos virales, los mecanismos moleculares que contribuyen a la progresión tumoral durante la hepatocarcinogénesis siguen siendo en gran medida desconocidos. La familia de proteínas Frizzled está

compuesta de diez o más proteínas de siete dominios transmembrana que actúan como receptores para proteínas Wnt. La red de señalización de Wnt/Frizzled influye en diversos procesos biológicos que varían de la determinación del destino de una célula a la motilidad y proliferación celular.

La !-catenina es una proteína multifactorial con un papel en la adhesión célula-célula que implica refuerzo del enlace de catenina y ∀-catenina con el citoesqueleto de actina. En ausencia de señalización de Wnt/Frizzled, la !-catenina se fosforila por interacciones con glucógeno sintasa quinasa (GSK) -3!, y forma un complejo con axina y la proteína de poliposis adenomatosa del colon (APC) . Posteriormente se dirige degradación a la !-catenina por el sistema de ubiquitin proteasoma. Por el contrario, la unión de un ligando Wnt con su receptor Frizzled estabiliza la !catenina intracelular mediante la inhibición de la actividad enzimática de GSK-3!. Posteriormente, la !-catenina se trasloca al núcleo en asociación con factores de dominio de grupo de alta movilidad tales como Tcf/Lef. Este complejo se asocia con regulación positiva de la transcripción de genes relacionados con la migración celular y el regulador del crecimiento.

La implicación de la ruta de transducción de señal de Wnt/!-catenina en la patogénesis molecular del

carcinoma hepatocelular humano (HCC) se ha descrito por Philippe Merle et al., (Gastroenterotogy 2004; 127: 11101122) y se ha indicado sobreexpresión del receptor Frizzled-7 (FDZ7) humano en HCC. Sin embargo, los mecanismos moleculares que pueden conducir a la regulación positiva del gen FZD7 eran desconocidos y no se analizaron las interacciones receptor-ligando específicas de FZD7.

FZD7 se describió adicionalmente en Jennifer Willert et al., (BMC Developmental Biology 2002, 2: 8) como un gen sensible a Wnt3A en células de carcinoma embrionario humano. Otras proteínas Wnt, tales como Wnt3 o Wnt11, no se han analizado en este estudio. Además, esta divulgación se restringe a células de carcinoma embrionario humano, sin mencionar o sugerir ningún papel o expresión de Wnt3A u otras proteínas Wnt en HCC o células del hígado.

Finalmente, se ha descrito un requisito de actividad de Wnt11 para regulación de los movimientos de gastrulación en vertebrados en el documento WO 03/092705 A1 y se creyó que Wnt11 señalizaba a través de FZD7. No se menciona la expresión de Wnt11 en otras células, tales como células del hígado, o regulación negativa de FZD7 a través de Wnt11.

Descripción resumida [0009] La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que Wnt 3, 8b y 11 son ligandos de Frizzled 7, que normalmente está sobreexpresado al nivel de ARNm y proteínas en HCC, por ejemplo, en HCC

relacionado con virus de hepatitis B (VHB) . Las células de cáncer de hígado que sobreexpresan Frizzled 7 muestran motilidad y migración celular potenciadas. La sobreexpresión parece ser un acontecimiento temprano durante el proceso multietapa de la transformación de hepatocitos, y por lo tanto Frizzled 7 y Wnt 3, 8b y 11 son nuevas dianas moleculares para la terapia de cáncer de hígado.

En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un agente anti cáncer de hígado. El método incluye seleccionar un compuesto de ensayo que se une con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína Wnt 3 o Wnt 11 o un fragmento de unión a FZD del mismo; y determinar si el compuesto de ensayo es capaz de (i) reducir la señalización de Wnt/FZD 7 en una célula de hígado, (ii) reducir 5 la motilidad de células de cáncer de hígado, (iii) reducir la acumulación de !-catenina en una célula de cáncer de hígado; o (iv) tratar el cáncer de hígado in vitro o en un animal no humano in vivo; en el que un compuesto de ensayo que es capaz de al menos uno de (i) a (iv) es un agente anti cáncer de hígado. En algunas realizaciones, la selección de un compuesto de ensayo puede incluir proporcionar un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de Wnt 3 o Wnt 11 o un fragmento de unión a FZD del mismo, poner en contacto el 10 polipéptido con un compuesto de ensayo, detectar la unión entre el polipéptido y el compuesto de ensayo, y seleccionar el compuesto de ensayo si se une al polipéptido. El polipéptido con el que se une un compuesto de ensayo puede ser (i) un polipéptido de origen natural, (ii) un polipéptido recombinante, (iii) un polipéptido expresado en la superficie de una célula o (iv) un polipéptido aislado. Cuando el polipéptido incluye la secuencia de aminoácidos de una proteína Wnt 3, el polipéptido puede incluir cualquiera de SEC ID Nº: 8 a 12. Cuando el

polipéptido incluye la secuencia de aminoácidos de una proteína Wnt 11, el polipéptido puede incluir cualquiera de SEC ID Nº: 22 a 26. En ciertas realizaciones, el polipéptido incluye cualquiera de SEC ID Nº: 7 a 13 y 21 a 27 y al menos una secuencia no Wnt. El compuesto de ensayo puede seleccionarse del grupo que consiste en polipéptidos, ácidos ribonucleicos, moléculas pequeñas (por ejemplo, moléculas pequeñas orgánicas) y ácidos desoxirribonucleicos.

Los agentes antineoplásicos identificados por los métodos para identificar un agente anti cáncer de hígado descrito en la presente memoria incluyen, pero sin limitación, un anticuerpo anti Wnt, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, receptores FZD7, fragmentos de unión a Wnt de receptores FZD7, y otros compuestos de unión a Wnt. Los agentes antineoplásicos identificados por estos métodos pueden usarse en el tratamiento de cáncer, por

ejemplo, cáncer de hígado. Adicionalmente, un agente antineoplásico identificado por estos métodos puede usarse para fabricar un medicamento para tratar cáncer de hígado o reducir la motilidad de células de cáncer de hígado en un paciente.

En otro aspecto, la invención incluye un método para identificar un agente anti cáncer de hígado candidato.

El método incluye (a) proporcionar un primer polipéptido que: (i) comprende un polipéptido de FZD 7 o un fragmento del mismo; y (ii) presenta capacidad de unión a Wnt (por ejemplo Wnt 3 u 11) ; (b) proporcionar un segundo polipéptido que: (i) comprende un polipéptido de Wnt 3 o Wnt 11 o un fragmento del mismo; y (ii) presenta capacidad de unión a FZD 7; (c) poner en contacto el primer y segundo polipéptidos en presencia de un compuesto de ensayo; y (d) comparar el nivel de unión entre el primer y segundo polipéptidos en presencia del compuesto de ensayo con el

nivel de unión en ausencia del compuesto de ensayo, en el que un nivel reducido de unión en presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia indica que el compuesto de ensayo es un agente antineoplásico candidato. El método puede incluir además: (e) determinar si el agente anticáncer de hígado candidato es capaz de:

(i) reducir la señalización de Wnt/FZD 7 en una célula que exprese FZD 7; (ii) reducir la motilidad de células de cáncer de hígado; (iii) reducir la acumulación de !-catenina en una célula de cáncer de hígado; o (iv) tratar el cáncer 40 de hígado in vitro o en un animal no humano in vivo; en el que un candidato que es capaz de al menos uno de (i) a (iv) es un agente anti cáncer de hígado. El compuesto de ensayo puede seleccionarse del grupo que consiste en polipéptidos, ácidos ribonucleicos, moléculas pequeñas (por ejemplo, moléculas orgánicas pequeñas) y ácidos desoxirribonucleicos. El polipéptido de Wnt puede incluir, por ejemplo,... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar un agente anti-cáncer de hígado, comprendiendo el método:

seleccionar un compuesto de ensayo que se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína Wnt3 o Wnt11 o un fragmento de unión a FZD de la misma; y determinar si el compuesto de ensayo es capaz de:

(a) reducir la señalización de Wnt/FZD 7 en una célula de hígado;

(b) reducir la motilidad de células de cáncer de hígado;

(c) reducir la acumulación de !-catenina en una célula de cáncer de hígado; o

(d) tratar el cáncer de hígado in vitro o en un animal no humano in vivo;

en el que un compuesto de ensayo que es capaz de al menos uno de (a) a (d) es un agente anti-cáncer de hígado. 15

2. El método de la reivindicación 1, en el que (a) la selección del compuesto de ensayo comprende:

poner en contacto el compuesto de ensayo con el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína Wnt3 o Wnt11 o un fragmento de unión a FZD del mismo; detectar la unión entre el polipéptido y el compuesto de ensayo, y seleccionar el compuesto de ensayo si se une con el polipéptido; y/o (b) el polipéptido se proporciona como:

(i) un polipéptido de origen natural;

(ii) un polipéptido recombinante;

(iii) un polipéptido expresado en la superficie de una célula; o (iv) un polipéptido aislado; y/o

(c) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína Wnt3; o

(d) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína Wnt3, en la que dicha secuencia de

aminoácidos comprende cualquiera de las SEC ID Nº: 8 a 12 y al menos una secuencia no Wnt, y/o 35 (e) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína Wnt11; o (f) el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de una proteína Wnt11, en la que dicha secuencia de aminoácidos comprende cualquiera de las SEC ID Nº: 22 a 26 y al menos una secuencia no Wnt.

3. Un compuesto para su uso en el tratamiento de cáncer de hígado o para su uso en la reducción de la motilidad de cáncer de hígado en un paciente, en el que el compuesto comprende:

(a) un anticuerpo anti-Wnt3;

(b) un anticuerpo anti-Wnt3 que se une a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos

LRAKYSLFKPPTERDL (SEC ID Nº: 80) ; 45 (c) un siARN que reduce la expresión de Wnt3 en el paciente; o (d) un siARN que reduce la expresión de Wnt3 en el paciente y comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: WNT3-1: 5’-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3’ (SEC ID Nº: 81) , WNT3-2: 5’-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3’ (SEC ID Nº: 82) y WNT3-3: 5’-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3’ (SEC ID Nº: 83) .

4. Un método para identificar un agente anti-cáncer de hígado candidato, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un primer polipéptido que:

(i) comprende un polipéptido de FZD 7 o un fragmento del mismo; y

(ii) presenta capacidad de unión con Wnt;

(b) proporcionar un segundo polipéptido que:

(i) comprende un polipéptido de Wnt 3 o Wnt 11 o un fragmento del mismo; y

(ii) presenta capacidad de unión con FZD 7;

(c) poner en contacto el primer y segundo polipéptidos en presencia de un compuesto de ensayo; y

(d) comparar el nivel de unión entre el primer y segundo polipéptidos en presencia del compuesto de ensayo con 65 el nivel de unión en ausencia del compuesto de ensayo, en el que un nivel reducido de la unión en presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia indica que el compuesto de ensayo es un agente anti-cáncer candidato, comprendiendo además opcionalmente el método:

(e) determinar si el agente anti-cáncer de hígado candidato es capaz de:

(i) reducir la señalización de Wnt/FZD 7 en una célula que exprese FZD 7;

(ii) reducir la motilidad de células de cáncer de hígado;

(iii) reducir la acumulación de !-catenina en una célula de cáncer de hígado; o (iv) tratar el cáncer de hígado in vitro o en un animal no humano in vivo;

en el que un candidato que es capaz de al menos uno de (i) a (iv) es un agente anti-cáncer de hígado.

5. El método de la reivindicación 4, en el que (a) el compuesto de ensayo se selecciona del grupo que consiste en polipéptidos, ácidos ribonucleicos, 15 moléculas pequeñas y ácidos desoxirribonucleicos; o (b) en el que el primer polipéptido es una primera proteína de fusión que comprende un polipéptido de FZD fusionado con:

(i) un dominio de activación de la transcripción de un factor de la transcripción o (ii) un dominio de unión a ADN de un factor de la transcripción; el segundo polipéptido es una segunda proteína de fusión que comprende un polipéptido de Wnt fusionado con (iii) un dominio de activación de la transcripción de un factor de transcripción o (iv) un dominio de unión a ADN de un factor de transcripción, en el que el polipéptido de Wnt está fusionado con un dominio diferente del fusionado con el polipéptido de FZD; y se detecta unión del primer y segundo 25 polipéptidos como reconstitución de un factor de transcripción; o

(c) en el que el segundo polipéptido comprende un polipéptido de Wnt3 o fragmento del mismo; o

(d) en el que el segundo polipéptido comprende cualquiera de SEC ID Nº: 8 a 12 y al menos una secuencia no

Wnt; 30 (e) en el que el segundo polipéptido comprende un polipéptido de Wnt11 o fragmento del mismo; o (f) en el que el segundo polipéptido comprende cualquiera de SEC ID Nº: 22 a 26 y al menos una secuencia no Wnt.

6. Un método para determinar si una célula de hígado es, o está en riesgo de convertirse en, una célula cancerosa, 35 comprendiendo el método:

(a) proporcionar una célula de hígado de ensayo obtenida de un paciente;

(b) determinar si el nivel de expresión de Wnt3 de la célula es mayor que el de una célula de control; y

(c) clasificar la célula de ensayo como una célula cancerosa o en riesgo de convertirse en una célula cancerosa, 40 si el nivel de expresión de Wnt3 de la célula de ensayo es mayor que el de la célula de control.

7. Un método para determinar si una muestra de tejido de un paciente que padece o está en riesgo de cáncer de hígado, comprendiendo el método:

(a) proporcionar una muestra de tejido hepático de ensayo obtenida del paciente, incluyendo una muestra que es tejido tumoral o tejido peritumoral; y

(b) determinar si el nivel de expresión de Wnt3 en la muestra de tejido de ensayo es mayor que el de una muestra de tejido comparable obtenida de un individuo sano, en el que un nivel de expresión mayor en la muestra de tejido de ensayo es un indicio de que el paciente padece o está en riesgo de cáncer; y opcionalmente 50 que comprende además (c) determinar si el nivel de expresión de Wnt11 en la muestra tisular de ensayo es menor que el de una muestra de tejido obtenida de un individuo sano, en el que un nivel menor de expresión de Wnt11 es un indicio de que el paciente padece o está en riesgo de cáncer.

8. El método de la reivindicación 6 ó 7:

(a) en el que determinar el nivel de expresión de Wnt3 incluye determinar la cantidad de ARNm de Wnt3 en la muestra celular de ensayo o de tejido de ensayo;

(b) en el que determinar el nivel de expresión de Wnt3 incluye determinar la cantidad de ARNm de Wnt3 en la 60 muestra celular o de tejido de ensayo usando un ensayo de transferencia de Northern o un ensayo de RT-PCR;

(c) en el que determinar el nivel de expresión de Wnt3 incluye determinar la cantidad de proteína Wnt3 en la muestra celular de ensayo o de tejido de ensayo;

(d) en el que determinar el nivel de expresión de Wnt3 incluye determinar la cantidad de proteína Wnt3 en la

muestra celular o de tejido de ensayo usando un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo que se une con la 65 secuencia de aminoácidos LRAKYSLFKPPTERDL (SEC ID Nº: 80) ; o (e) que comprende además determinar si el nivel de expresión de Wnt11 en la célula de ensayo o el tejido de ensayo es menor que el de una célula de control o tejido de control, en el que un menor nivel de expresión de Wnt11 indica que (i) la célula de ensayo es, o está en riesgo de convertirse en, una célula cancerosa o (ii) el paciente padece o está en riesgo de cáncer.

9. Un anticuerpo que se une a la secuencia de aminoácidos LRAKYSLFKPPTERDL (SEC ID Nº: 80) .

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.

11. El anticuerpo de la reivindicación 9 para su uso en terapia.

12. El anticuerpo de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento del cáncer de hígado.

13. Una composición que comprende un siARN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: WNT3-1: 5’-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3’ (SEC ID Nº: 81) , WNT3-2: 5’-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3’ (SEC ID Nº: 82) y WNT3-3: 5’-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3’ (SEC ID Nº: 83) para su uso en el tratamiento de cáncer de hígado.

14. Una composición que comprende un polipéptido de Wnt11 o una construcción genética que codifica un polipéptido de Wnt11 para su uso en el tratamiento del cáncer de hígado.

15. La composición de la reivindicación 14, en la que la composición se administra directamente al hígado del paciente in situ.

16. El anticuerpo de la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fab o un 30 fragmento F (ab’) 2.

Frizzled 7 humana Referencia: 075084 Nombre de la proteína: Frizzled 7 [Precursor] DEFINICIÓN: frizzled 7; Frizzled/ drosophila, homólogo de, 7; Frizzled (Drosophila) homólogo 7 [Homo sapiens]. REFERENCIA NP_003498

Sitio de unión al ligando potencial de Frizzled 7 humana * Dominio rico en cisteína (CRD)

Frizzled 7 de ratón

Frizzled 8 humana

Referencia: Q9H461 Nombre de la proteína: Frizzled 8 [Precursor]

Origin (694 aa)

Sitio de unión a ligando potencial de FZD8 humano * Dominio rico en cisteína (CRD)

Frizzled 8 de ratón

Wnt3 humana

Motivos de Unión Potenciales Wnt3 humana * Proteína de factor de crecimiento secretado (motivo o dominio)

1) RESAFVHAIASAGVA (110-124) (SEC ID Nº: 8) 2) RSCAEGTSTICGCD (129-142) (SEQ ID N0:9) 3) WKWGGCSEDADFG (153-165) (SEC ID Nº: 10) 4) CKCHGLSGSCEVKTCW (206-221) (SEC ID Nº: 11) 5) DLVYYENSPNFC (273-284) (SEC ID Nº:12)

Wnt3 de ratón Referencia: P17553 Nombre de la proteína: proteína del proto-oncogén Wnt-3 Precursor] DEFINICIÓN: sitio de integración de MMTV relacionado con wingless 3 [Mus musculus].

REFERENCIA NP_033547

Wnt8B humana

Motivos de unión potenciales Wnt8b humana * Proteína de factor de crecimiento secretado (motivo o dominio)

1) RETAFVHAISSAGVM (83-97) (SEC ID Nº: 15) 2) RNCSLGDFDNCGCD (102-115) (SEC ID Nº:16) 3) WLWGGCSDNVGFG (127-139) (SEC ID Nº: 17) 4) CKCHGVSGSCTTQTCW (180-195) (SEC ID Nº: 18) 5) ELVHLEDSPDYC (245-256) (SEC ID Nº:19)

Wnt8B de ratón

Referencia: Q9WUD6 Nombre de la proteína: proteína Wnt-8b [Precursor] DEFINICIÓN: sitio de integración de MMTV relacionado con wingless 8b [Mus musculus]. REFERENCIA NP_035850

Wnt 11 humana Referencia: 096014 Nombre de la proteína: proteína Wnt-11 [Precursor] DEFINICIÓN: familia del sitio de integración de MMTV de tipo wingless, Precursor del miembro 11 [Homo sapiens] REFERENCIA NP_004617

Motivos de unión potenciales

Wnt11 humana * Proteína de factor de crecimiento secretado (motivo o dominio)

1) RESAFVYALSAAAIS (109-123) (SEC ID Nº:22) 2) RACTSGDLPGCSCG (128-141) . (SEC ID Nº:23) 3) NRWGGCADNLSYG (152-164) (SEC ID Nº:24) 4) CKGHGVSGSCSIRTCW (209-224) (SEC ID Nº: 25) 5) ELVYLQSSPDFC (272-283) (SEC ID Nº: 26)

Wnt 11 de ratón Referencia: P48615 Nombre de la proteína: proteína Wnt-11 [Precursor] DEFINICIÓN: sitio de integración de MMTV relacionado con wingless 11 [Mus musculus]. REFERENCIA NP_033545

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citadas en la descripción