TRATAMIENTOS PARA INCREMENTAR EL VIGOR DE PLANTAS LEÑOSAS EN CONDICIONES IN VITRO Y SU MÉTODO DE APLICACIÓN.

Tratamientos para incrementar el vigor de plantas leñosas en condiciones in vitro y su método de aplicación.

La presente invención proporciona tratamientos eficaces, para aumentar el crecimiento de plantas leñosas (preferentemente melocotonero y ciruelo) en condiciones in vitro. La presente invención muestra como la adición de benzotiodiazol (BTH) o ácido L-2-oxo-4-tiazolidina carboxílico (OTC), a bajas concentraciones, al medio de cultivo para la micropropagación de dichas plantas, actúa promoviendo el crecimiento de los explantos de forma muy significativa.

En un aspecto particular la invención se refiere a un método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro que comprende los siguientes pasos, (i) establecimiento de cultivo de explantos in vitro de plantas leñosas, (ii) subcultivo de dichos explantos en medio y condiciones idóneas para el cultivo in vitro, (iii) adición al medio de cultivo a baja concentración de uno de los dos compuestos BTH u OTC respetuosos con el medio ambiente y metabolizables por las plantas y el (iv) subcultivo de los explantos en el medio que contiene los compuesto en condiciones idóneas para el cultivo in vitro.

Tratamientos para incrementar el vigor de plantas leñosas en condiciones in vitro y su método de aplicación.

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuadra dentro del campo de la Agricultura. Es aplicable en empresas que se dediquen a la micropropagación de plantas leñosas así como a viveristas.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las técnicas de micropropagación in vitro son útiles para producir grandes cantidades de material propagado, y en muchos casos son la respuesta a los problemas que presentan los métodos tradicionales de propagación vegetativa. También suponen una técnica muy útil para el estudio de la fisiología del estrés, sobre todo en aquellas plantas con un ciclo vegetativo largo y crecimiento lento como las leñosas. La micropropagación de frutales (plantas leñosas) se ha venido utilizando desde los años 70 y es una excelente herramienta para estudiar el efecto de diferentes condiciones de estrés sobre el metabolismo de las mismas a más corto plazo que en condiciones de invernadero o de campo. En este sentido constituyen una excelente alternativa para el estudio de respuestas a diferentes situaciones de estrés en programas de mejora genética, y la evaluación de resistencias a situaciones de estrés. Un problema significativo en estos programas de mejora vegetal es la complejidad del método analítico requerido, que combina la dificultad entre el desarrollo de las plantas en invernadero o en el campo y el espacio y tiempo consumidos así como el caro mantenimiento de las plantas.

La micropropagación es una técnica que proporciona plantas de características homogéneas y certificadamente sanas. La utilización de esta técnica se basa en la existencia de un método de regeneración in vitro de plantas completas, de su multiplicación y de su aclimatación o adaptación a condiciones exteriores. La disponibilidad de protocolos para la regeneración eficiente de plantas vigorosas con un buen crecimiento es un requisito clave para su desarrollo. Tanto para una eficiente multiplicación como para asegurar una exitosa aclimatación de la plantas a condiciones ex vitro es necesario disponer de un cultivo estable y plántulas con un buen crecimiento y vigor. Sin embargo, y especialmente en frutales, el establecimiento y multiplicación de los cultivos in vitro puede plantear dificultades de crecimiento y elongación de brotes a partir de los explantos iniciales. Otro de los problemas cruciales en la micropropagación de leñosas es la pérdida de la capacidad de enraizamiento, siendo la aclimatación un aspecto clave en el proceso de micropropagación de frutales leñosos. En este sentido, cualquier tratamiento que aumente el vigor del explanto va a proporcionar una mayor probabilidad de éxito para la aclimatación de plantas leñosas. Tal y como ha descrito Gonzalez-Padilla et al. (2003) , la altura de los explantos y el número de hojas son factores determinantes para el éxito de la aclimatación ex vitro de plantas de ciruelo en invernadero, mientras que no parece ser tan determinante la longitud y el número de raíces.

Se han descrito varias estrategias para mejorar la elongación de los explantos. Una de ellas es la etiolación, es decir la exposición de los explantos a la ausencia de luz. Es un método eficaz pero si la incubación en oscuridad se prolonga podría causar la muerte de los explantos (Piqueras y Debergh 1999) . Otra estrategia consiste en incubar los explantos ya establecidos en un medio en ausencia de hormonas (Piqueras y Debergh 1999) . También se ha utilizado el tidiazurón (TDZ) que tiene un fuerte efecto en la proliferación de tallos en especies leñosas (Huetteman y Preece 1993) . Sin embargo, TDZ puede estimular la inducción de callos y la organogénesis de los tallos, que eventualmente puede amenazar la uniformidad de las plantas micropropagadas generando variaciones somaclonales (Mok et al 1987) . Otro método descrito para aumentar elongación de tallos in vitro, es la aplicación del sistema de doble capa. Este método puede conseguir al mismo tiempo la elongación y enraizamiento de los explantos. Sin embargo, se trata de un sistema complejo y costoso (De Riek et al 1997) . Más recientemente, Kalinina y Brown (2007) han empleado un medio de cultivo para la micropropagación de explantos de melocotonero GF305 en el que utilizaban frucosa y ácido ferúlico. De esta forma, se reducía la necrosis apical y mejoraba la elongación y la supervivencia de los explantos. Clemente-Moreno y colaboradores han empleado un medio similar para la micropropagación de melocotonero GF305, y han descrito que ese efecto beneficioso en el crecimiento del melocotonero GF305, en relación a otros medios de cultivo usados, puede ser debido a que el ácido ferúlico es un inhibidor competitivo de la actividad peroxidada (POX) (Clemente-Moreno et al., 2011) , así como a sus propiedades antioxidantes (Graf 1992) . Las peroxidasas están relacionadas con la síntesis de ligninas y la lignificación es parte de la diferenciación de la pared celular e irreversiblemente inhibe la elongación celular (Pomar et al. 2002) . En este sentido, algunos autores han descrito una correlación negativa entre el aumento de la actividad peroxidasa (POX) y crecimiento (Fr y 1979, Li and Kao 2001) .

Por lo tanto actualmente no existen estrategias que permitan la elongación de plantas in vitro de forma eficaz, por ello, es necesario desarrollar nuevos métodos o aplicaciones para inducir vigor en los procesos de micropropagación de plantas leñosas y para mejorar el proceso de aclimatación a condiciones ex vitro, que a su vez permita la obtención de plantas más resistentes a estreses ambientales.

El benzotiodiazol (BTH) es un análogo funcional del ácido salicílico. Las aplicaciones que se han descrito para este compuesto están relacionadas con la protección frente a infecciones por hongos (mildew, Görlach et al., 1996) , bacterias (Pseudomonas syringae Lawton et al., 1996) o virus de plantas como el virus del mosaico del tabaco (TMV) (Friedich et al., 1996) o el virus del mosaico del calabacín (CMV) (Anfoka, 2000) . Además se ha descrito una protección frente a estrés oxidativo inducido por tratamiento con herbicidas (Körzer et al., 1999) .

El ácido L-2-oxo-4-tiazolidina carboxílico (OTC) es un precursor artificial de la cisteína (Williamson and Meister, 1981) , cuya aplicación produce un aumento en los niveles del tripéptido glutatión reducido (GSH) . Las aplicaciones que se han descrito para este compuesto en plantas están relacionadas con protección frente a la infección por virus de plantas: tabaco frente al virus del mosaico del tabaco (Tobacco mosaic Virus TMV) (Gullner et al., 1999) ; calabaza frente al virus del mosaico amarillo de la calabaza (Zucchini Moaci Virus ZYMV) (Zechmann et al., 2007) o guisante frente a PPV (Clemente-Moreno et al., 2010) .

Sin embargo, no se han descrito otras aplicaciones de estos compuestos para el crecimiento de plantas en condiciones in vitro. No existe mucha información acerca del efecto de ambos productos en el crecimiento de plantas e incluso se ha descrito un efecto negativo de la aplicación del BTH en el crecimiento de algunas especies vegetales en condiciones de campo, invernadero o cámara de crecimiento. En plantas de guisante crecidas en medios hidropónicos se ha descrito una reducción del crecimiento de la parte aérea, con un tratamiento con BTH 0.25 mM mientras que con OTC 1 mM se ha descrito un aumento en un 10% (Clemente-Moreno et al. 2010) . En plantas de tomate no se observaron cambios significativos en el crecimiento por efecto del BTH, mientras que en coliflor, el BTH reducía el crecimiento en un rango del 5.9% al 38.3% dependiendo de la concentración usada (Anfoka et al., 2000; Godard et al., (1999) . Sin embargo, no existen datos acerca de la aplicación de BTH o de OTC en cultivos en condiciones in vitro ni tampoco sobre los posibles efectos de la fisiología y el crecimiento de plantas micropropagadas, particularmente en leñosas.

El objeto de la presente invención se centra en el desarrollo de aplicaciones para inducir vigor en los procesos de micropropagación de plantas leñosas y para mejorar el proceso de aclimatación a condiciones ex vitro, que a su vez permita la obtención de plantas más resistentes a estreses ambientales, las aplicaciones desarrolladas se basan en el uso del BTH o el OTC y su novedad radica en que nunca antes BTH u OTC se habían aplicado en el medio de cultivo, a baja concentración, para favorecer el crecimiento de plantas micropropagadas En este sentido, cualquier tratamiento que aumente el vigor del explanto va a proporcionar una mayor probabilidad de éxito para la aclimatación de plantas leñosas, y en concreto de melocotonero GF305, planta usada de forma común... [Seguir leyendo]

1. Un método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro que comprende los siguientes pasos,

(i) establecimiento de cultivo de explantos in vitro de plantas leñosas,

(ii) subcultivo de los explantos en medio y condiciones idóneas para el cultivo in vitro,

(iii) adición al medio de cultivo a baja concentración de uno de los dos compuestos BTH u OTC respetuosos con el medio ambiente y metabolizables por las plantas,

(iv) subcultivo de los explantos en el medio que contiene el compuesto en condiciones idóneas para el cultivo in vitro.

2. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho establecimiento de cultivo de explantos in vitro de plantas leñosas (i) se realiza a partir de yemas preformadas de tallos jóvenes, a partir de hipocotilos de semillas o a partir de cualquier otro tejido vegetal idóneo para el establecimiento de cultivo in vitro de plantas leñosas.

3. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho subcultivo de los explantos en medio y condiciones idóneas para el cultivo in vitro (ii) se realiza durante un periodo entre 4 y 5 semanas.

4. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha adición al medio de cultivo a baja concentración de uno de los dos compuestos BTH u OTC respetuosos con el medio ambiente y metabolizables por las plantas se realiza mediante adición al medio de cultivo de BTH a concentraciones entre 1 y 35 μM.

5. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según la reivindicación 4, caracterizado por que dicha adición al medio de cultivo de BTH se realiza a concentraciones entre 5 y 25 μM.

6. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según la reivindicación 5, caracterizado por que dicha adición al medio de cultivo de BTH se realiza a una concentración entre 10 y 20 μM.

7. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según la reivindicación 1, caracterizado por que dicha adición al medio de cultivo a baja concentración de uno de los dos compuestos BTH u OTC respetuosos con el medio ambiente y metabolizables por las plantas se realiza mediante adición al medio de cultivo de OTC a concentraciones entre 2 y 100 μM.

8. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según la reivindicación 7, caracterizado por que dicha adición al medio de cultivo de OTC se realiza a concentraciones entre 10 y 100 μM.

9. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho subcultivo de los explantos en el medio que contiene los compuestos en condiciones idóneas para el cultivo in vitro (iv) se realiza durante un periodo de 4 a 5 semanas.

10. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que se aplica para optimizar e incrementar el crecimiento y brotación de explantos de frutales de hueso.

11. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que se aplica para optimizar e incrementar el crecimiento y brotación de explantos de frutales del género Prunus.

12. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que se aplica para optimizar e incrementar el crecimiento y brotación de explantos de melocotonero.

13. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que se aplica para optimizar e incrementar el crecimiento y brotación de explantos de frutales de ciruelo.

14. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se incrementan las defensas de los explantos de melocotonero a estreses bióticos y abióticos, mediante la inducción de la SEQ ID No: 1.

15. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según

cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se aumenta la capacidad antioxidante de los explantos de melocotonero mediante su incremento en el estado redox del glutatión.

16. El método de tratamiento para incrementar el vigor en plantas leñosas en condiciones in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se obtiene una optimización del crecimiento de los explantos in vitro para su posterior aclimatación a condiciones ex vitro.

FIGURA 2

FIGURA 4

FIGURA 7