Tratamiento de biopelícula.

Una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor para su uso en prevenir,

inhibir o reducir una biopelícula de P. gingivalis en un sujeto en la que el agente inhibidor está seleccionado del grupo que consiste en oxantel, morantel o tiabendazol

Tratamiento de biopelícula.

Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones para prevenir o alterar la formación y/o desarrollo de biopelícula bacteriana tal como aquellas que contienen Porphyromonas gingivalis. En particular, la presente invención se refiere a la reivindicación 1.

Antecedentes de la invención Muchos tratamientos bacterianos están dirigidos a bacterias en un estado planctónico. Sin embargo, las patologías bacterianas incluyen bacterias en un estado de biopelícula. Por ejemplo, Porphyromonas gingivalis se considera que es el principal agente causante de enfermedad periodontal crónica. La lesión de tejido asociada a la enfermedad se produce por una respuesta inmunitaria del huésped desregulada a P. gingivalis que crece como parte de una biopelícula bacteriana polimicrobiana sobre la superficie de los dientes. Las biopelículas bacterianas son ubicuas en la naturaleza y se definen como poblaciones bacterianas encerradas en matriz adherentes entre sí y/o a superficies o interfases (1) . Estas células bacterianas sésiles que se adhieren a y crecen sobre una superficie como una biopelícula madura pueden sobrevivir en entornos hostiles que pueden incluir la presencia de agentes antimicrobianos, fuerzas de cizallamiento y privación de nutrientes.

Los Centros para el control y la prevención de enfermedades estiman que el 65% de las infecciones bacterianas humanas implican biopelículas. Las biopelículas frecuentemente complican el tratamiento de infecciones crónicas protegiendo bacterias del sistema inmunitario, disminuyendo la eficacia de antibióticos y dispersando células planctónicas a sitios distantes que pueden ayudar en la reinfección (2, 3) . La placa dental es un ejemplo clásico de una biopelícula bacteriana en la que una alta diversidad de especies forman una biopelícula polimicrobiana heterogénea que crece sobre la superficie de los dientes. La superficie de los dientes es un hábitat microbiano único ya que es la única superficie que no se muda permanente dura en el cuerpo humano. Esto permite la acreción de una biopelícula bacteriana sustancial durante un periodo de tiempo prolongado a diferencia de superficies mucosas en las que la eliminación de células epiteliales limita el desarrollo de la biopelícula. Por tanto, los cambios al proteoma de P. gingivalis que se producen entre los estados planctónicos y de biopelícula son importantes para el entendimiento de los presentes inventores de la progresión de enfermedad periodontal crónica.

P. gingivalis se ha clasificado en dos amplios grupos de cepas incluyendo las cepas W50 y W83 que se han descrito como invasivas en modelos de lesión animal mientras que las cepas que incluyen 381 y ATCC 33277 se describen como menos invasivas (4, 5) . Griffen y col. (6) encontraron que cepas similares a W831W50 estuvieron más asociadas a enfermedad periodontal humana que otras cepas de P. gingivalis, que incluyen cepas similares a 381, mientras que Cutler y col. (7) demostraron que cepas invasivas de P. gingivalis fueron más resistentes a fagocitosis que las cepas no invasivas. La comparación de la cepa W83 de P. gingivalis secuenciada con la cepa ATCC 33277 tipo indicó que el 7% de los genes estuvieron ausentes o altamente divergentes en la cepa 33277, que indica que hay diferencias considerables entre las cepas (8) . De forma interesante, la cepa W50 de P. gingivalis forma biopelículas solo escasamente bajo la mayoría de las circunstancias en comparación con la cepa 33277, que fácilmente forma biopelículas (9) . Como consecuencia de esto se han realizado relativamente pocos estudios sobre la formación de biopelícula por W50 de P. gingivalis.

El documento GB 2381449 desvela composiciones que comprenden cinco compuestos de nitroimidazol para tratar enfermedad periodontal producida por P. gingivalis.

Se han empleado estudios proteómicos cuantitativos para determinar cambios del proteoma de patógenos bacterianos humanos tales como Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Streptococcus mutans del estado planctónico a de biopelícula usando enfoques de electroforesis en gel 2D en los que se calculan relaciones de proteínas basándose en la intensidad de la tinción del gel (10-12) . Una alternativa es usar técnicas de marcado con isótopos estables tales como ICAT, iTRAQ o agua pesada (H218O) con cuantificación por EM (13) . La base para el marcado con H218O es que durante la hidrólisis de proteínas se ha demostrado que endopeptidasas tales como tripsina demostraron incorporar dos átomos de 18O en los extremos C de los péptidos resultantes (14, 15) . Además de usarse en la determinación de las abundancias de proteínas relativas (16-19) , el marcado con 18O en proteómica también se ha usado para la identificación del extremo C de la proteína, identificación de glucosilación ligada a N después de la eliminación enzimática del glucano, simplificación de la interpretación de datos de EM/EM y más recientemente para la validación de sitios de fosforilación (20-23) . El procedimiento de marcado proteolítico con16O/18O para medir la abundancia de proteínas relativa implica digerir una muestra en H216O y la otra muestra en H218O. Los digestos se combinan entonces antes del análisis por EM-CL/EM. Los péptidos que eluyen de la columna de CL pueden cuantificarse midiendo la intensidad de señal relativa de los pares iónicos del péptido en el modo de EM. La incorporación de dos átomos de 18O en el extremo C de péptidos digeridos por tripsina produce un desplazamiento de la masa de +4 m/z que permite la identificación de los pares de isótopos.

Debido a la complejidad del proteoma, etapas de prefraccionamiento son ventajosas para aumentar el número de identificaciones de péptidos y proteínas. La mayoría de las etapas de prefraccionamiento implican un enfoque de CL 2D al nivel de péptidos después de la digestión en disolución (24, 25) . Sin embargo, debido a la posible pérdida de muestras durante las etapas de deshidratación iniciales de la disolución de proteína, el prefraccionamiento por SDS-PAGE al nivel de proteína seguido del marcado con 16O/18O durante la digestión en gel también se ha llevado a cabo satisfactoriamente (26-29) . El marcado proteolítico con 16O/18O es una metodología altamente específica y versátil, pero se han realizado pocos estudios de validación a gran escala (30) . Se llevó a cabo un excelente estudio de validación por Qian y col. (18) que marcaron dos alícuotas similares de proteínas del suero en una relación 1:1 y obtuvieron una relación promedio de 1, 02 ± 0, 23 de 891 péptidos. Un estudio más reciente por Lane y col. (26) demostró adicionalmente la factibilidad del procedimiento de 16O/18O usando una estrategia de marcado inverso para determinar la abundancia relativa de las 17 proteínas de citocromo P450 entre ratones de control y tratados con inductores de citocromo P450 que se injertaron con tumores humanos.

Resumen de la invención La presente invención usó un sistema por el cual W50 de P. gingivalis se cultiva en cultivo continuo y se desarrolla una biopelícula madura sobre las superficies verticales en el recipiente del quimiostato durante un periodo de tiempo prolongado. La biopelícula final es similar a la que se habría observado en condiciones de progresión de la enfermedad, permitiendo así una comparación directa entre células de biopelícula y planctónicas. El marcado proteolítico con 16O/18O usando una estrategia de marcado inverso se llevó a cabo después del prefraccionamiento por SDS-PAGE de la fracción de la envuelta de células de P. gingivalis seguido de acoplamiento a EM CL MALDI TOF/EM fuera de línea para la identificación y cuantificación. De las 116 proteínas identificadas, 81 se encontraron coherentemente en dos estudios en cultivo continuo independientes. Se encontró que 47 proteínas con una variedad de funciones aumentaron o disminuyeron coherentemente en abundancia en las células de biopelícula proporcionando posibles dianas para las estrategias de control de biopelículas. De estas 47 proteínas, los presentes inventores han seleccionado 24 proteínas que creen que son particularmente útiles como dianas en el tratamiento y/o prevención de infección por P. gingivalis. Éstas se enumeran en la Tabla 4 más adelante.

Por consiguiente, los presentes inventores describen un polipéptido bacteriano aislado, purificado o recombinante que modula la formación de biopelícula por bacterias. Preferentemente, las bacterias son anaerobias. En una realización, las bacterias son dependientes de fumarato reductasa (Frd) , tal como aquellas del género Porphyromonas. Una bacteria preferida es P. gingivalis.

Los polipéptidos descritos en el presente documento para P. gingivalis tienen una secuencia... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor para su uso en prevenir, inhibir o reducir una biopelícula de P. gingivalis en un sujeto en la que el agente inhibidor está seleccionado del grupo que consiste en 5 oxantel, morantel o tiabendazol.

2. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que el agente inhibidor es oxantel.

3. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que el agente inhibidor es morantel. 10

4. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que el agente inhibidor es tiabendazol.