SISTEMA Y PROCEDIMIENTO MULTIANALÍTICO BASADO EN MEDICIONES IMPEDIMÉTRICAS.

Sistema y procedimiento multianalítico basado en mediciones impedimétricas.



La invención describe un sistema para la detección y/o cuantificación simultánea de varios analitos en una muestra o bien para la detección y/o cuantificación simultánea de un analito en varias muestras, que comprende: un chip (10) multielectrodo que comprende un conjunto de microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d); una celda (20) de conducto único, que comprende una ranura (21) que aloja el chip (10) multielectrodo y un conducto (22) por el que una muestra fluida puede circular secuencialmente por cada uno de los microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) de un chip (10) multielectrodo cuando éste está alojado en la ranura (21); y una celda (30) de conductos múltiples, que comprende una ranura (31) que aloja el chip (10) multielectrodo y varios conductos (32a, 32b, 32c, 32d) independientes por los que varias muestras pueden circular independientemente por cada electrodo (11a, 11b, 11c, 11d) del chip (10) multielectrodo.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200931164.

Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: SANCHEZ BAEZA, FRANCISCO JOSE, ABRAMOVA,NATALIA, RAMON AZCON,JAVIER, MARCO COLAS,MARIA PILAR, BRATOV NIKIFOROV,Andrei, IPATOV,Andrey.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N27/02 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 27/00 Investigación o análisis de materiales mediante el empleo de medios eléctricos, electroquímicos o magnéticos (G01N 3/00 - G01N 25/00 tienen prioridad; medida o ensayo de variables eléctricas o magnéticas o de las propiedades eléctricas o magnéticas de los materiales G01R). › investigando la impedancia.
  • G01N27/07 G01N 27/00 […] › Estructura de los recipientes de medida; Electrodos para estos recipientes.
  • G01N33/53 G01N […] › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/538 G01N 33/00 […] › por columna, partículas o banda de resina sintética absorbentes o adsorbentes.
SISTEMA Y PROCEDIMIENTO MULTIANALÍTICO BASADO EN MEDICIONES IMPEDIMÉTRICAS.

Fragmento de la descripción:

Sistema y procedimiento multianalítico basado en mediciones impedimétricas.

Objeto de la invención El objeto principal de la invención es un sistema y procedimiento para la detección y/o cuantificación simultánea de varios analitos en una única muestra o bien para la detección y/o cuantificación simultánea de un único analito en varias muestras.

Antecedentes de la invención Es conocido que las medidas de impedancia permiten detectar variaciones extremadamente pequeñas en las propiedades y composición química de los electrodos utilizados para realizar la medición así como de la superficie de los mismos y del medio entre ellos. Este hecho ha permitido registrar fenómenos como la formación de un complejo antígeno anticuerpo en la superficie del electrodo (Bataillard, P. et al., Anal. Chem., 1988, 60, 2374) . Los primeros sistemas eran incapaces de detectar compuestos minoritarios y menos aún a nivel de trazas en las muestras a analizar. Para aumentar la sensibilidad de la técnica y además poder miniaturizar los dispositivos, se desarrollaron los transductores basados en electrodos interdigitados (P. van Gerwen et al., Sens. Actua. B, 1998, 49, 73) . La utilización de estos tipos de electrodos como sensores químicos mediante medidas impedimétricas ha sido recogida en patentes con diversas concepciones (WO2004044570) y en esencia se basan en inmovilizar el compuesto que juega el papel de receptor en la superficie del electrodo y ponerlo en contacto con la muestra a analizar. Si existe el compuesto complementario este se unirá al receptor modificando la naturaleza de la capa superficial del transductor y modificando la impedancia de la misma. La magnitud del cambio es proporcional a la cantidad de compuesto que se ha unido al transductor la cual a su vez depende de la cantidad del mismo presente en la muestra. La correlación se puede realizar con el valor de la impedancia a una o varias frecuencias de interrogación o mediante el ajuste de la respuesta en función de la frecuencia a un circuito equivalente y correlacionar el valor de uno o varios de los componentes con la concentración del analito.

A pesar de las mejoras anteriores los sistemas aún no tenían la sensibilidad requerida para la detección y cuantificación de compuestos a nivel de trazas y menos aún si se trataba de compuestos de bajo peso molecular (menos de 1000 Dalton) . Una mejora importante en el diseño de los transductores fue el desarrollo de los electrodos interdigitados con barreras aislantes entre los elementos conductores con una altura del orden de la separación de los electrodos recogida en la patente ES2307430. Con este dispositivo transductor se puede detectar compuestos de bajo peso molecular con una sensibilidad similar a la de los ensayos de tipo ELISA que utilizan el mismo juego de inmunoreactivos.

Junto a los precedentes en tecnología de sensores impedimétricos hay que añadir los precedentes en técnicas inmunoquímicas de análisis de tipo multianalito. En general los métodos multianalito se realizan por separación en el espacio de cada inmunoensayo elemental de forma que el sistema multianalito no pasa de ser un sistema de n-ensayos para n analitos diferentes. Este sistema no explota la extremada selectividad que muestran los anticuerpos por sus substratos (similar a la de los enzimas por los suyos) . Una mejora al sistema convencional y que de alguna manera recuerda a como funciona el sistema inmune es utilizar un coctel con los anticuerpos que van a reconocer los diferentes analitos ya que no van a haber reacciones cruzadas entre ellos. Esta estrategia es la que se recoge en el trabajo sobre un ensayo ELISA multianalito para la detección de diversas familias de antibióticos en leche (Adrian J. et al, Anal and Bioanal Chem., 2008, 391, 1703) . Dado que se trataba de moléculas de bajo peso molecular se requería un ensayo de tipo competitivo donde se había inmovilizado de forma separada en la placa de pocillos el competidor apropiado para cada analito lo que permitía obtener de forma separada las señalas para cada uno a pesar de utilizar una mezcla de anticuerpos sobre la muestra. Este trabajo demuestra la posibilidad de trabajar con mezclas de anticuerpos sin que la señal no específica sea mayor que en los ensayos individuales y sin que haya interferencia entre la respuesta para los diferentes analitos.

Descripción de la invención El objetivo de la presente invención es un sistema de análisis capaz de detectar simultáneamente la presencia de un único analito en varias muestras, o bien de detectar simultáneamente la presencia de varios analitos en una única muestra. Para ello se describe un sistema biosensor multianalito o multimuestra de alta sensibilidad basado en un array de electrodos interdigitados con barreras, un sistema de flujo que combina dos tipos de cámaras de muestra (una multicelda y otra de celda única) y un inmunoensayo multianalito por mezcla de anticuerpos específicos.

El término “analito” tal como se entiende en la presente invención es el componente que se pretende detectar y/o cuantificar en una muestra. En este sentido, el analito puede ser un elemento, un compuesto o un ión, es decir, una especie química que puede ser detectada y/o cuantificada. Un compuesto es una sustancia formada por la unión de 2 o más elementos de la tabla periódica, en una razón fija. Un compuesto está formado por moléculas o iones con enlaces estables.

Asimismo el analito/s de interés en una muestra puede ser de naturaleza inorgánica, orgánica o bioquímica. El analito puede tener naturaleza biológica y por tanto, podría comprender cualquier molécula de origen biológico o cualquier tipo de célula, orgánulo celular o cualquier parte de éstos. En este sentido el término “molécula de origen biológico” comprende, pero sin limitarse, bioelementos (elementos químicos que aparecen en los seres vivos) , ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, enzimas, glúcidos, lípidos, vitaminas, anticuerpos u hormonas.

El analito de la presente invención puede detectarse o cuantificarse de forma indirecta a través de la detección o cuantificación de un anticuerpo capaz de reconocer al analito de forma específica. Esto sería en el caso de que la muestra proceda de un organismo cuyo sistema inmunológico pueda generar anticuerpos específicos que reconozcan a dicho antígeno.

El analito de la presente invención puede estar presente:

-En una muestra alimentaria (residuos de fármacos veterinarios en productos de origen animal, residuos de pesticidas en productos vegetales o contaminación microbiológica) .

-En una muestra de origen biológico, más concretamente de origen clínico.

-En una muestra procedente de cualquier compartimento medioambiental (compuestos orgánicos de origen antropogénico; restos de fármacos, pesticidas o productos industriales) .

Un primer aspecto de la invención describe un sistema analítico impedimétrico múltiple que comprende un chip multielectrodo, una celda de conducto único y una segunda celda de conductos múltiples. A continuación se describe cada uno de estos elementos.

a) Chip multielectrodo Se trata de un chip que comprende un conjunto de microelectrodos cuya impedancia cambia cuando se pone en contacto con una muestra en la que esta presente un analito particular. Así, a partir del cambio en la impedancia de un microelectrodo, se puede calcular la cantidad de analito presente en la muestra.

Con el objeto de describir el chip multielectrodo de la invención, en el presente documento el término “extremo distal” hace referencia al extremo sobre el cual están situados los microelectrodos, y que se introduce en la ranura de la celda correspondiente, mientras que el “extremo proximal” del chip multielectrodo es el extremo opuesto, que queda fuera de la ranura.

En una realización preferida de la invención, los microelectrodos del extremo distal del chip multielectrodo están unidos eléctricamente, mediante unas pistas conductoras, con unos conectores situados en el extremo proximal. Tanto los microelectrodos como las pistas conductoras se fabrican empleando un material de alta conductividad, preferiblemente TaSi2. Además, unas barreras dieléctricas entre los microelectrodos aseguran evitan cortocircuitos entre ellos, mientras que las pistas, a su vez, están recubiertas por un material dieléctrico de protección. En realizaciones preferidas de la invención, tanto las barreras dieléctricas como el recubrimiento de las pistas están hechos de SiO2.

En una realización preferida de la invención, el chip multielectrodo se conecta, por medio de los conectores situados en su extremo proximal, a un dispositivo de excitación y procesamiento....

 


Reivindicaciones:

1. Sistema multianalítico múltiple basado en muestras impedimétricas para la detección y/o cuantificación simultánea de varios analitos en una única muestra o para la detección simultánea de un analito en varias muestras, caracterizado porque comprende:

-un chip (10) multielectrodo que comprende un conjunto de microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) ;

-una celda (20) de conducto único, que comprende una ranura (21) adecuada para alojar el chip (10) multielectrodo y un único conducto (22) por el que una muestra fluida puede circular secuencialmente por cada uno de los microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) de un chip (10) multielectrodo cuando éste está alojado en la ranura (21) ;

-una segunda celda (30) de conductos múltiples, que comprende una ranura (31) adecuada para alojar el chip

(10) multielectrodo y varios conductos (32a, 32b, 32c, 32d) independientes por los que varias muestras fluidas pueden circular de manera independiente por cada electrodo (11a, 11b, 11c, 11d) del chip (10) multielectrodo.

2. Sistema analítico impedimétrico múltiple de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende un dispositivo de excitación y procesamiento conectado al chip (10) multielectrodo.

3. Sistema analítico impedimétrico múltiple de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque los electrodos (11a, 11b, 11c, 11d) , situados en un extremo distal (D) del chip (10) multielectrodo, están conectados eléctricamente mediante unas pistas (12a, 12b, 12c, 12d, 12e) con unos conectores (13a, 13b, 13c, 13d, 13e) , situados en un extremo proximal (P) , que permiten la conexión de dicho chip (10) multielectrodo con el dispositivo de excitación y procesamiento.

4. Sistema analítico impedimétrico múltiple de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque los microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) y las pistas (12a, 12b, 12c, 12d, 12e) están hechos de TaSi2.

5. Sistema analítico impedimétrico múltiple de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-4, caracterizado porque además comprende unas barreras dieléctricas que separan los electrodos (11a, 11b, 11c, 11d) unos de otros.

6. Sistema analítico impedimétrico múltiple de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, caracterizado porque además comprende un recubrimiento dieléctrico para la protección de las pistas (12a, 12b, 12c, 12d, 12e) .

7. Sistema analítico impedimétrico múltiple de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque las barreras dieléctricas y el recubrimiento dieléctrico están hechos de SiO2.

8. Sistema analítico impedimétrico múltiple de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque cada celda (20, 30) está fijada a dos láminas (23, 24, 33, 34) de soporte, formando una estructura tipo “sándwich”.

9. Procedimiento para la detección y/o cuantificación simultánea de varios analitos en una única muestra mediante el sistema analítico impedimétrico múltiple de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque comprende las siguientes operaciones:

-introducir el chip (10) multielectrodo en la ranura (31) de la celda (30) de conductos múltiples;

-hacer fluir por cada uno de los conductos (32a, 32b, 32c, 32d) un compuesto adecuado para conseguir la fijación sobre cada microelectrodo (11a, 11b, 11c, 11d) de un receptor o competidor selectivo para cada analito que se desea detectar;

-extraer el chip (10) multielectrodo de la celda (30) de conductos múltiples e introducirlo en la ranura (21) de la celda (20) de conducto único; y

-hacer fluir la única muestra mezclada con un cocktail de inmunoreactivos apropiado a cada analito por el conducto (22) de la celda (20) de conducto único, quedando fijado cada uno de los analitos deseados al correspondiente microelectrodo (11a, 11b, 11c, 11d) .

10. Procedimiento para la detección y/o cuantificación simultánea de varios analitos en una única muestra de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende las siguientes operaciones:

-realizar una primera medición de la conductividad de los microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) con anterioridad al paso de la muestra por dichos microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) ;

-realizar una segunda medición de la conductividad de los microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) después del paso de la muestra por dichos microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) y de una etapa posterior de lavado; y

-determinar, a partir de las dos mediciones anteriores, la cantidad de cada analito en cada microelectrodo (11a, 11b, 11c, 11d) .

11. Procedimiento para la detección y/o cuantificación simultánea de un único analito en varias muestras mediante el sistema analítico impedimétrico múltiple de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque comprende las siguientes operaciones:

-introducir el chip (10) multielectrodo en la ranura (21) de la celda (20) de conducto único;

-hacer fluir por el conducto (22) un compuesto adecuado para conseguir la fijación sobre cada microelectrodo (11a, 11b, 11c, 11d) de un receptor o competidor selectivo para el analito que se desea detectar;

-extraer el chip (10) multielectrodo de la celda (20) de conducto único e introducirlo en la ranura (31) de la celda

(30) de conductos múltiples; y

-hacer fluir una muestra por cada conducto (32a, 32b, 32c, 32d) de la celda (30) de conductos múltiples, quedando fijado el analito deseado a cada microelectrodo (11a, 11b, 11c, 11d) .

12. Procedimiento para la detección y/o cuantificación simultánea de un único analito en varias muestras de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende las siguientes operaciones:

-realizar una primera medición de la conductividad de los microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) previamente al paso de las muestras por dichos microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) ;

-realizar una segunda medición de la conductividad de los microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) después del paso de las muestras por dichos microelectrodos (11a, 11b, 11c, 11d) y de una etapa posterior de lavado; y

-determinar, a partir de las dos mediciones anteriores, la cantidad del analito en cada microelectrodo (11a, 11b, 11c, 11d) .


 

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