Sistema de ensayo para la evaluación de la oncogenicidad, progresión tumoral y eficacia de un tratamiento.

Método que comprende: medir los niveles de proteínas implicadas en apoptosis en una muestra de tejido obtenida de un animal,

en el que las proteínas consisten en p53, Bid, caspasa-3 y citocromo C; comparar los niveles de las proteínas en la muestra de tejido con un valor de referencia; en el que la referencia se obtiene a partir de una muestra previa obtenida del animal de una región de tejido 10 normal; y en el que una disminución en p53, una disminución en caspasa-3, una disminución en Bid y una disminución en citocromo C indica que la muestra contiene células que son resistentes a la apoptosis y que la muestra es cancerosa.

Sistema de ensayo para la evaluación de la oncogenicidad, progresión tumoral y eficacia de un tratamiento Antecedentes El cáncer es actualmente una de las principales causas de muerte en los países desarrollados. La investigación reciente ha aumentado enormemente la comprensión de muchos de los mecanismos moleculares de la tumorigénesis y ha proporcionado numerosas nuevas vías para el tratamiento del cáncer. Se usan clínicamente sistemas y métodos para evaluar el estadio de un cáncer, así como su oncogenicidad y el grado de progresión tumoral, en un intento por determinar tratamientos apropiados. Tales sistemas y métodos también pueden utilizarse para evaluar la eficacia de cualquier tratamiento utilizado.

Siguen siendo deseables métodos mejorados para el tratamiento de enfermedades, incluyendo cáncer, que permitan 15 la evaluación de la oncogenicidad, progresión tumoral y eficacia de un tratamiento.

Ahmed F. (Expert Rev. Mol. Diagn. 5 (3) , 2005; págs. 353 -375) trata marcadores moleculares que predicen la respuesta a la terapia del cáncer de colon. Zisman A. et al. (Cancer Research 63, 4952 -4959, 15 de agosto de 2003; págs. 4952 -4959) tratan LABAZI, un modelo de tumor metastásico para carcinoma de células renales que expresa el antígeno tumoral anhidrasa carbónica tipo 9. El documento WO 02/37113 trata la validación clínica y funcional de dianas a partir de células cancerosas diseminadas.

Sumario La presente descripción proporciona kits de ensayo y sistemas adecuados para su uso en el tratamiento del cáncer. Los sistemas y kits de la presente descripción permiten determinar la naturaleza cancerosa de una muestra de tejido, tal como evaluando el estadio de un cáncer, así como su oncogenicidad y el grado de progresión tumoral. Los kits y sistemas de la presente descripción también pueden utilizarse para determinar tratamientos apropiados así como la eficacia de cualquier tratamiento utilizado. En realizaciones, sistemas y kits de la presente descripción pueden utilizarse ensayos, en realizaciones ELISA, para examinar los niveles de marcadores apoptóticos, marcadores de angiogénesis, marcadores de inmunomodulación y/o marcadores del ciclo celular, y pueden compararse muestras de un paciente tomadas a diferentes tiempos para determinar la oncogenicidad de un cáncer, la progresión tumoral y la eficacia de un tratamiento contra el cáncer.

En realizaciones, un kit o sistema de la presente descripción puede utilizar un programa de software para analizar los datos generados por los ensayos de la presente descripción. En realizaciones, un kit o sistema de la presente descripción puede incluir un ensayo para medir un nivel de una proteína en una muestra de tejido implicada en un proceso celular tal como apoptosis, angiogénesis, inmunomodulación, desarrollo del ciclo celular y combinaciones de los mismos; y al menos un procesador acoplado a un medio legible por ordenador configurado para almacenar un conjunto de instrucciones que pueden ejecutarse por el al menos un procesador, incluyendo las instrucciones comparar un nivel de la proteína en la muestra de tejido con un valor de referencia, y determinar si la muestra de tejido es cancerosa o no.

También se proporcionan métodos que utilizan tales kits y sistemas. En realizaciones, los métodos de la presente 45 descripción pueden incluir métodos para determinar la naturaleza cancerosa de una muestra de tejido, tal como evaluando la oncogenicidad de un cáncer, determinando la progresión de un tumor, determinando la eficacia de un tratamiento contra el cáncer, combinaciones de los mismos, y similares.

Descripción de los dibujos 50 Se describirán a continuación en el presente documento diversas realizaciones de la presente descripción con referencia a las figuras en las que:

la figura 1 incluye el análisis de la apoptosis de una muestra a partir de un informe de ensayo que puede generarse 55 con los sistemas y kits de la presente descripción;

la figura 2 incluye el análisis de la angiogénesis de una muestra a partir de un informe de ensayo que puede generarse con los sistemas y kits de la presente descripción;

la figura 3 incluye el análisis de la inmunomodulación de una muestra a partir de un informe de ensayo que puede generarse con los sistemas y kits de la presente descripción; y

la figura 4 incluye el análisis del ciclo celular de una muestra a partir de un informe de ensayo que puede generarse con los sistemas y kits de la presente descripción.

Descripción detallada La presente descripción proporciona un sistema de ensayo que examina proteínas celulares que desempeñan un papel vital en la apoptosis (muerte celular programada) , angiogénesis (crecimiento de nuevos vasos sanguíneos) , inmunomodulación y factores del ciclo celular contribuyendo de ese modo al nivel global de oncogenicidad. Una célula cancerosa presenta señalización alterada de la expresión génica/proteica de factores relacionados con los procesos mencionados anteriormente. Esto conduce a: un desequilibrio de la homeostasis; pérdida de vigilancia inmunitaria y control apoptótico; mutaciones de la autorregulación inducida por tumores; y aumento de la vasculatura. Estos se combinan para convertirse en los factores desencadenantes que impulsan la aparición de oncogénesis. Por ejemplo, un aumento de la expresión de Bcl-2, que previene la apoptosis, combinado con una regulación por disminución de la expresión Bax, puede ser indicativo de resistencia apoptótica. Por tanto, la medición de la expresión de proteínas como Bax y Bcl-2 antes y después de un tratamiento contra el cáncer puede proporcionar una perspectiva de si un régimen de tratamiento restaura eficazmente el potencial apoptótico en tejido maligno.

Según la presente descripción, se proporcionan sistemas y kits que incluyen múltiples ensayos que pueden utilizarse para evaluar la malignidad de un cáncer, incluyendo su oncogenicidad, así como la progresión de tumores y la eficacia de tratamientos. Puede utilizarse un componente del ensayo de apoptosis del sistema para indicar si las células están experimentando muerte celular programada a una tasa normal, o si las células no están muriendo como deberían, lo que podría ser indicativo de la naturaleza maligna de las células. Una parte del ensayo de angiogénesis del sistema puede medir las secreciones y los receptores celulares de células cancerosas para determinar su capacidad para estimular la formación de nuevos vasos sanguíneos que pueden proporcionar nutrientes para facilitar el crecimiento tumoral.

Estos valores pueden utilizarse para cuantificar la progresión de un tumor y la eficacia de tratamientos antiangiogénicos. Pueden utilizarse mediciones de la inmunomodulación para indicar la respuesta inmunitaria para el crecimiento no controlado de células y el nivel de infiltración en el microentorno tumoral. Finalmente, pueden utilizarse factores del ciclo celular para evaluar la tasa de recambio celular, que es indicativa de la agresividad con la que el tumor puede estar creciendo.

Las cuatro categorías (apoptosis, angiogénesis, inmunomodulación y factores del ciclo celular) pueden clasificarse en una escala numérica individualmente, sin embargo, un médico puede evaluar los cuatro valores dados conjuntamente, para monitorizar y elegir y seguir un régimen de tratamiento para un tumor maligno.

Una ventaja tecnológica de un kit o sistema de ensayo de la presente descripción incluye el software que acompaña al kit o sistema que analizará las proteínas para clasificar la progresión tumoral y la eficacia de un tratamiento en una lectura numérica sencilla. En una realización, pueden analizarse los niveles de tantas como 25 proteínas para clasificar la progresión tumoral y la eficacia de un tratamiento en una lectura numérica sencilla.

Construcción de un kit de ELISA:

En realizaciones, el sistema de ensayo de la presente descripción puede incluir un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) . Puede utilizarse cualquier sistema de ELISA dentro del ámbito de los expertos en la técnica. En realizaciones, el kit de ELISA puede prepararse usando una ruta directa. En otras realizaciones, el kit de ELISA puede prepararse usando una ruta indirecta.

Para un kit de ELISA preparado usando una ruta directa, un método adecuado para producir el kit de ELISA incluye la unión de un anticuerpo de interés a la base de una placa de 96 pocillos de plástico. Entonces se dispensa una muestra al pocillo y la proteína diana se unirá a los anticuerpos. Tras eliminar por lavado las proteínas que no reaccionaron, puede añadirse a los pocillos en la placa un segundo anticuerpo monoclonal unido a una enzima de registro. Este... [Seguir leyendo]

1. Método que comprende:

5 medir los niveles de proteínas implicadas en apoptosis en una muestra de tejido obtenida de un animal, en

el que las proteínas consisten en p53, Bid, caspasa-3 y citocromo C;

comparar los niveles de las proteínas en la muestra de tejido con un valor de referencia;

10 en el que la referencia se obtiene a partir de una muestra previa obtenida del animal de una región de tejido

normal; y en el que una disminución en p53, una disminución en caspasa-3, una disminución en Bid y una

disminución en citocromo C indica que la muestra contiene células que son resistentes a la apoptosis y que

la muestra es cancerosa.

15 2. Sistema para llevar a cabo el método según la reivindicación 1 que comprende al menos un procesador

acoplado a un medio legible por ordenador configurado para almacenar un conjunto de instrucciones que

pueden ejecutarse por el al menos un procesador, incluyendo las instrucciones:

comparar los niveles de proteínas en una muestra de tejido de un animal con un valor de referencia, en el

20 que las proteínas consisten en p53, caspasa-3, Bid y citocromo C, en el que la referencia se obtiene a partir

de una muestra previa obtenida del animal de una región de tejido normal; y en el que una disminución en

p53, una disminución en caspasa-3, una disminución en Bid y una disminución en citocromo C indica que la

muestra contiene células que son resistentes la apoptosis y que la muestra es cancerosa.

25 3. Sistema que comprende:

ensayos para medir los niveles de proteínas implicadas en apoptosis en una muestra de tejido, en el que

las proteínas consisten en p53, Bid, caspasa-3 y citocromo C y al menos un procesador acoplado a un

medio legible por ordenador configurado para almacenar un conjunto de instrucciones que pueden

30 ejecutarse por el al menos un procesador, incluyendo las instrucciones las etapas de:

comparar los niveles de las proteínas en la muestra de tejido con un valor de referencia, en el que la

referencia se obtiene a partir de una muestra previa obtenida del animal de una región de tejido normal; y

en el que una disminución en p53, una disminución en caspasa-3, una disminución en Bid y una

35 disminución en citocromo C indica que la muestra contiene células que son resistentes a la apoptosis y que

la muestra es cancerosa.