Retirada de agregados de alto peso molecular usando cromatografía de hidroxiapatita.

Un procedimiento de purificación de al menos un monómero de anticuerpo de una preparación de anticuerpo quecontiene agregados de alto peso molecular que comprende someter la preparación de anticuerpo a cromatografía dehidroxiapatita,

en el que la cromatografía de hidroxiapatita comprende poner en contacto una resina de hidroxiapatitaen una columna con la preparación de anticuerpo en un tampón de carga que comprende fosfato sódico 1 - 20 mM yNaCl 0,2 - 2,5 M y permitir que el anticuerpo purificado fluya a través de la columna

Retirada de agregados de alto peso molecular usando cromatografía de hidroxiapatita Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos de retirada de agregados de alto peso molecular de una preparación de anticuerpo usando cromatografía de hidroxiapatita. En ciertas realizaciones de la presente invención, se puede reducir considerablemente la cantidad de agregados de alto peso molecular presente en la preparación final, tal como desde un 40% a menos de un 1%.

Antecedentes de la invención Es deseable identificar procedimientos útiles de purificación de proteínas que no destruyan, o reduzcan considerablemente, la actividad biológica de la proteína. Se deben retirar los contaminantes de las preparaciones de anticuerpo antes de que se puedan usar en aplicaciones de diagnóstico, aplicaciones terapéuticas, biología celular aplicada, y estudios funcionales. Las preparaciones de anticuerpo recolectadas de líneas celulares de hibridoma, por ejemplo, contienen a menudo componentes no deseados, tales como agregados de alto peso molecular (HMWA) del anticuerpo producido por la línea celular. Esta formación de agregados puede afectar negativamente a la seguridad del producto al causar activación del complemento o anafilaxis tras su administración. Además, la formación del agregado puede dificultar el procedimiento de fabricación al causar descenso del rendimiento de producto, ampliación del pico, y pérdida de actividad.

Los procedimientos de purificación de proteínas más comunes se basan en las diferencias de tamaño, carga, y solubilidad entre la proteína que se va a purificar y los contaminantes. Los protocolos basados en estos parámetros incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía de interacción hidrofóbica. Estos procedimientos cromatográficos, sin embargo, presentan en ocasiones dificultades técnicas en la separación de agregados o de especies multiméricas de anticuerpos. Técnicas tales como la cromatografía de intercambio iónico y de interacción hidrofóbica, por ejemplo, pueden inducir la formación de agregados debido a un aumento de la concentración de proteínas o de los cambios requeridos en la concentración y/o el pH del tampón durante la elución. Además, en algunos casos los anticuerpos muestran diferencias en los puntos isoeléctricos que son demasiado pequeñas para permitir su separación mediante cromatografía de intercambio iónico. Tarditi, J. Immunol. Methods 599:13-20 (1992) . La cromatografía de exclusión por tamaño es incómoda y da como resultado una dilución considerable del producto, que es un impedimento en los procedimientos de fabricación a gran escala basados en la eficacia. También se puede producir fuga de ligandos de las columnas de cromatografía de afinidad, lo que da como resultado la contaminación no deseada del producto eluido. Steindl, J. Immunol. Methods 235:61-69 (2000) . Los solicitantes intentaron retirar HMWA de una preparación de anticuerpo anti-GDF-8 usando cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, así como cromatografía de interacción hidrofóbica. Sin embargo, todos estos procedimientos fueron incapaces de retirar considerablemente HMWA de la preparación de anticuerpo anti-GDF-8.

La cromatografía de hidroxiapatita es un procedimiento de purificación de proteínas que usa fosfato de calcio hidroxilado insoluble [Ca10 (PO4) 6 (OH) 2], que forma tanto la matriz como el ligando. Los grupos funcionales consisten en pares de iones calcio cargados positivamente (sitios C) y agrupaciones de grupos fosfato cargados negativamente (sitios P) . Las interacciones entre la hidroxiapatita y las proteínas son complejas y multimodales. En un procedimiento de interacción, sin embargo, los grupos amino de las proteínas cargados positivamente se asocian con los sitios P cargados negativamente y los grupos carboxilo de las proteínas interaccionan por complejación de coordinación con los sitios C. Shepard, J. of Chromatography 891:93-98 (2000) .

La hidroxiapatita cristalina fue el primer tipo de hidroxiapatita usado en cromatografía, pero estaba limitada por dificultades estructurales. La cromatografía de hidroxiapatita cerámica (cHA) se desarrolló para superar algunas de las dificultades asociadas a la hidroxiapatita cristalina, tales como los caudales limitados. La hidroxiapatita cerámica posee alta durabilidad, buena capacidad de unión a proteínas, y se puede usar con caudales y presiones mayores que la hidroxiapatita cristalina. Vola y col., BioTechniques 14:650-655 (1993) .

La hidroxiapatita se ha usado en la separación cromatográfica de proteínas, ácidos nucleicos, así como anticuerpos. En la cromatografía de hidroxiapatita, la columna se equilibra normalmente, y la muestra se aplica en una baja concentración de tampón fosfato y las proteínas adsorbidas se eluyen a continuación en un gradiente de concentración de tampón fosfato. Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000) . En ocasiones, se usan con éxito bajos gradientes de fosfato sódico para eluir proteínas, mientras que en otros casos se han usado con éxito gradientes de concentración de fosfato sódico de hasta 400 mM. Véase, por ejemplo Stanker, J. Immunological Methods 76:157-169 (1985) (gradiente de elución de fosfato sódico de 10 mM a 30 mM) ; Shepard, J. Chromatography 891:93-98 (2000) (gradiente de elución de fosfato sódico de 10 mM a 74 mM) ; Tarditi, J. Chromatography 599:13-20 (1992) (gradiente de elución de fosfato sódico de 10 mM a 350 mM) . Mientras que se han incorporado sales tales como NaCl en el tampón de unión para purificar un anticuerpo usando cromatografía de hidroxiapatita, Giovannini, R. Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000) , no se conocía que sales tales como NaCl y (NH4) 2SO4 afectaran a la elución de las proteínas en cromatografía de hidroxiapatita. Karlsson y col.,

Ion Exchange Chromatography, en Protein Purification, VCH Publishers, Inc. (Janson y Ry den eds., 1989) .

En algunos casos, los investigadores han sido incapaces de eluir selectivamente anticuerpos a partir de hidroxiapatita o descubrieron que la cromatografía de hidroxiapatita no daba como resultado un producto lo suficientemente puro. Junbauer, J. Chromatography 476: 257-268 (1989) ; Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000) . Los solicitantes intentaron separar sin éxito agregados de alto peso molecular de una preparación de anticuerpo usando cromatografía de hidroxiapatita cerámica y una elución de fosfato sódico basada en las enseñanzas de la técnica anterior (Figura 1) . Además, se sabe que las condiciones de elución severas, cuando se usan en un intento de romper la fuerte unión de una proteína a una matriz, destruye en la actividad biológica de la proteína. Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos eficientes para la retirada de impurezas, tales como agregados de alto peso molecular, de preparaciones de anticuerpo, que no destruyan la actividad biológica de los anticuerpos.

Sumario de la invención Los solicitantes descubrieron sorprendentemente que se puede usar NaCl en un nuevo procedimiento de cromatografía de hidroxiapatita para la purificación de inmunoglobulinas y la retirada de HMWA de diferentes materiales de partida (Figura 2) . Por lo tanto, la presente invención se refiere a procedimientos para la retirada de agregados de alto peso molecular de preparaciones de anticuerpo poniendo en contacto dicha preparación con una resina de hidroxiapatita. El tampón de la preparación de anticuerpo se puede intercambiar a un tampón de equilibrado y a continuación permitir que fluya a través de una resina de hidroxiapatita.

En una realización, la invención se refiere un procedimiento para la purificación de al menos un monómero de anticuerpo de una preparación de anticuerpo que contiene a agregados de alto peso molecular que comprende someter la preparación de anticuerpo a cromatografía de hidroxiapatita, en el que la cromatografía de hidroxiapatita comprende poner en contacto una resina de hidroxiapatita en una columna con la preparación de anticuerpo en un tampón de carga que comprende fosfato sódico de 1 a 20 mM y NaCl de 0, 2 a 2, 5 M y permitir que el anticuerpo purificado fluya a través de la columna.

La invención ofrece un tampón de carga que contiene fosfato sódico de 1 a 20 mM y NaCl de 0, 2 a 2, 5 M, en el que el tampón de carga tiene un pH de 6, 4 a 7, 6.

En una realización, el anticuerpo purificado contiene menos de un 5% de agregados de alto peso molecular.

En una realización más, el anticuerpo purificado contiene menos de un 1% de agregados de alto peso molecular.

En una... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de purificación de al menos un monómero de anticuerpo de una preparación de anticuerpo que contiene agregados de alto peso molecular que comprende someter la preparación de anticuerpo a cromatografía de hidroxiapatita, en el que la cromatografía de hidroxiapatita comprende poner en contacto una resina de hidroxiapatita en una columna con la preparación de anticuerpo en un tampón de carga que comprende fosfato sódico 1 -20 mM y NaCl 0, 2 -2, 5 M y permitir que el anticuerpo purificado fluya a través de la columna.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además someter la preparación de anticuerpo a (a) cromatografía de afinidad de Proteína A, y (b) cromatografía de intercambio iónico.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la cromatografía de afinidad de Proteína A se realiza en primer lugar y la cromatografía de hidroxiapatita se realiza en último lugar.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el tampón de carga tiene un pH de 6, 4 a 7, 6.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el tampón de carga comprende fosfato sódico 3 mM a5mM.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el tampón de carga comprende NaCl 0, 35 M a 1M.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el tampón de carga tiene un pH de 6, 8 a 7, 2.

8. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG, IgA, IgD, IgE, IgM.

9. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo que es monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado, o un fragmento de los mismos.

10. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-receptor de IL-21, anti-GDF-8, anti-Abeta, anti-CD22, anti-Lewis Y, anti-IL-13, o anti-IL-22.

11. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo tiene un pl básico.

12. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la resina es hidroxiapatita cerámica de tipo I o de tipo II.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la resina es hidroxiapatita cerámica de tipo I.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en el que la cromatografía de intercambio iónico es cromatografía de intercambio aniónico.

15. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la columna se lava para permitir que un anticuerpo purificado adicional fluya a través de la columna.

16. Un procedimiento para la purificación de al menos un monómero de anticuerpo de una preparación de anticuerpo que contiene agregados de alto peso molecular que comprende:

(a) poner en contacto la preparación de anticuerpo con un soporte de Proteína A;

(b) permitir que el anticuerpo se adsorba al soporte de Proteína A;

(c) lavar el soporte de Proteína A y el anticuerpo adsorbido con al menos un tampón de lavado de Proteína A;

(d) eluir el anticuerpo adsorbido con al menos un tampón de elución de Proteína A;

(e) poner en contacto el eluato de Proteína A con un soporte de intercambio iónico;

(f) purificar parcialmente el anticuerpo sobre el soporte de intercambio iónico;

(g) intercambiar el anticuerpo parcialmente purificado a un tampón de carga que comprende fosfato sódico 1 a 20mM y NaCl 0, 2 a 2, 5M;

(h) poner en contacto el anticuerpo parcialmente purificado en el tampón de carga con una resina de hidroxiapatita;

(i) permitir que el anticuerpo fluya a través de la resina de hidroxiapatita; y

(j) lavar la resina de hidroxiapatita con al menos un tampón de lavado de hidroxiapatita.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el tampón de carga tiene un pH de 6, 4 a 7, 6.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, en el que el tampón de carga comprende fosfato sódico 5 mM.

19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que el tampón de carga comprende NaCl 350 mM.

20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que el tampón de carga tiene un pH de 6, 8.

21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG, IgA, IgD, IgE, o IgM.

22. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que el anticuerpo es monoclonal, policlonal, 5 quimérico, humanizado, o un fragmento del mismo.

23. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en el que el anticuerpo es un anticuerpo antireceptor de IL-21, anti-GDF-8, anti-Abeta, anti-CD22, anti-Lewis Y, anti-IL-13, o anti-IL-22.

24. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que el anticuerpo tiene un pl básico.

25. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, en el que la resina es hidroxiapatita cerámica de 10 tipo I o de tipo II.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la resina es hidroxiapatita cerámica de tipo I.

27. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, en el que la cromatografía de intercambio iónico es cromatografía de intercambio aniónico.

28. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 27, que comprende además filtrar el anticuerpo

parcialmente purificado antes de la aplicación a la resina de hidroxiapatita, reduciendo de ese modo los contaminantes virales.

29. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 28, que comprende además someter el flujo continuo de hidroxiapatita a al menos una de ultrafiltración o diafiltración.