Reactivo de lisis no desnaturalizante.

Un método para preparar una muestra de ensayo para uso en un ensayo para un analito que es una molécula noproteica,

cuyo método consiste en poner en contacto la muestra de ensayo con un reactivo de lisis para formar unamezcla de lisis, incluyendo el reactivo de lisis un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol,propilenglicol y un glicol que tiene de dos a seis átomos de carbono, donde el nivel de glicol es de entre el 10% y el40% del reactivo de lisis;

donde se incluye en el reactivo de lisis o se añade a la mezcla de lisis al menos un alcohol que tiene cinco o menoscarbonos, la proporción entre glicol y alcohol es de 4:1 a 1:4 y, tras la adición del alcohol, la mezcla de lisis es unamezcla homogénea;

el método no incluye el contacto de la muestra de ensayo o de la mezcla de lisis con un detergente; y

la mezcla de lisis está lista para el análisis sin necesidad de una etapa de centrifugación.

Reactivo de lisis no desnaturalizante

Campo técnico

Esta invención se relaciona con un reactivo de lisis no desnaturalizante útil, por ejemplo, en inmunoensayos de diagnóstico para determinar los niveles de concentración de un fármaco inmunosupresor en una muestra de ensayo, según se define en las reivindicaciones adjuntas.

Antecedentes Muchos analitos de interés clínico son captados por las células o forman complejos con uno o más de otros componentes de la muestra de ensayo. Por consiguiente, para obtener una medición precisa de la cantidad de analito presente en la muestra, es preferible tratar la muestra y/o realizar el ensayo en condiciones tales que el analito se libere de las células u otro (s) componente (s) para su detección en el ensayo.

Por ejemplo, los fármacos inmunosupresores, tales como el tacrolimus, el everolimus, el temsorolimus y la ciclosporina, son efectivos para el tratamiento del rechazo de órganos o tejidos después de una cirugía de trasplante, de la enfermedad del injerto contra el huésped y de enfermedades autoinmunes en humanos. Durante la terapia con fármacos inmunosupresores, la monitorización de los niveles de concentración en sangre del inmunosupresor es un aspecto importante del cuidado clínico, ya que niveles insuficientes del fármaco conducen a rechazo del injerto (órgano o tejido) y niveles excesivos conducen a efectos colaterales y toxicidades no deseados. Se miden, por lo tanto, los niveles en sangre de inmunosupresor de tal forma que se puedan ajustar las dosificaciones del fármaco para mantener el nivel del fármaco a la concentración apropiada. Los ensayos diagnósticos para la determinación de los niveles en sangre de inmunosupresor han encontrado, por lo tanto, un amplio uso clínico.

Inicialmente, se debe extraer y separar el inmunosupresor de los otros componentes de la muestra del paciente. El grueso del fármaco inmunosupresor en la muestra del paciente está presente en un complejo con diversas moléculas "portadoras", tales como proteínas de unión. El sirolimus, el tacrolimus y la ciclosporina se encuentran predominantemente en los hematíes de los especímenes de los pacientes y se asocian con proteínas de unión específicas, FKBP para el sirolimus y el tacrolimus y ciclofilina para la ciclosporina. Para asegurar una medición precisa de la concentración de fármaco total en el espécimen, preferiblemente se libera el fármaco unido a las proteínas de unión antes de la cuantificación. Se ha abordado esto usando detergentes para lisar las células y/o solventes orgánicos para desnaturalizar las proteínas de la muestra.

Después de su extracción de las proteínas de unión, se puede medir el fármaco en una serie de formas diferentes, incluyendo por inmunoensayo o cromatografía con absorbancia o detección espectrofotométrica de masas. Los inmunoensayos para fármacos inmunosupresores están disponibles en una variedad de formatos, pero todos utilizan la unión de un anticuerpo o proteína de unión (v.g., FKBP) al fármaco inmunosupresor. Un ensayo comúnmente utilizado es un ensayo que conlleva la unión de un primer anticuerpo al inmunosupresor y la unión de inmunosupresor marcado (v.g., acridinio-sirolimus) a los sitios de unión del anticuerpo libre restantes, seguido de cuantificación por detección del marcaje.

EE.UU. 5.135.875 A describe un reactivo de precipitación para uso en sistemas analíticos para la determinación de analitos hidrofóbicos en una muestra de ensayo biológica, particularmente sistemas analíticos que emplean proteínas de unión específicas para dichos analitos.

WO 98/00696 A1 describe composiciones y kits para pretratar muestras que han de ser analizadas en cuanto a la presencia y/o cantidad de un analito asociado. La composición incluye un alcohol alquílico inferior en una cantidad de aproximadamente un 30% a aproximadamente un 40% en volumen, un glicol en una cantidad de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 40% en volumen y un componente acuoso que incluye sal de cobre de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 30 mM.

EP 0.753.744 A2 proporciona un método de ensayo de una muestra de sangre o de componentes de la sangre en cuanto a la concentración de un ligando de inmunofilina, que consiste en incubar la muestra con un detergente no iónico y una proteasa, inactivar luego la proteasa y determinar a continuación la concentración del ligando de inmunofilina en la muestra.

Resumen Según una primera realización, la presente invención proporciona un método para preparar una muestra de ensayo

para uso en un ensayo para un analito que es una molécula no proteica, cuyo método consiste en poner en contacto la muestra de ensayo con un reactivo de lisis para formar una mezcla de lisis, consistiendo el reactivo de lisis en un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol que tiene de dos a seis átomos de carbono, donde el nivel de glicol es de entre el 10% y el 40% del reactivo de lisis, donde se incluye al menos un alcohol que tiene cinco o menos carbonos en el reactivo de lisis o se añade a la mezcla de lisis, la proporción entre glicol y alcohol es de 4:1 a 1:4 y, después de la adición del alcohol, la mezcla de lisis es una mezcla homogénea; el método no incluye el contacto de la muestra de ensayo o de la mezcla de lisis con un detergente, y la mezcla de lisis está lista para el análisis sin necesidad de una etapa de centrifugación.

El alcohol puede ser, por ejemplo, metanol, etanol y/o propanol. En realizaciones particulares, la muestra de ensayo incluye una muestra de sangre humana.

Como ventajas del método de preparación de muestras de la invención, se incluye el que la muestra puede ser preparada para su análisis sin una etapa de centrifugación y sin el uso de un detergente.

En realizaciones preferidas, se incluye el alcohol en el reactivo de lisis. En variaciones de dichas realizaciones, la proporción entre glicol y alcohol es de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2. Se puede añadir la muestra de ensayo a cualquiera de dichos reactivos de lisis en una proporción de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2.

Cuando se lleva a cabo el método antes de un ensayo para un analito que está unido a una o más proteínas de unión en la muestra de ensayo, el método puede adicionalmente incluir el contacto de la muestra de ensayo o de la mezcla de lisis con un agente que libere el analito de la (s) proteína (s) de unión. El agente de liberación puede ser, por ejemplo, un agente que compita con el analito por la unión a la (s) proteína (s) de unión. En una realización ejemplar, el analito incluye un fármaco inmunosupresor y el agente incluye un fármaco inmunosupresor diferente, aunque estructuralmente similar. Cuando el analito incluye una molécula no proteica, el agente puede, por ejemplo, incluir una proteasa que degrade la (s) proteína (s) de unión.

Otro aspecto de la invención es una mezcla de reactivo de lisis, que comprende: una muestra de ensayo que consiste en una muestra de sangre humana y que puede incluir un analito que sea una molécula no proteica; un reactivo de lisis consistente en un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol que tiene de dos a seis átomos de carbono, donde el nivel de glicol es de entre el 10% y el 40% del reactivo de lisis; y al menos un alcohol que tiene cinco o menos carbonos, donde la proporción de glicol a alcohol es de 4:1 a 1:4; donde la mezcla de reactivo de lisis es una mezcla homogénea y la mezcla de reactivo de lisis no incluye un detergente y está lista para el análisis sin necesidad de una etapa de centrifugación. En realizaciones ejemplares, la proporción de glicol a alcohol es de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:2. Se añade típicamente esta mezcla de glicol-alcohol a la muestra de ensayo, en realizaciones ejemplares, en una proporción de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2.

El alcohol puede ser, por ejemplo, metanol, etanol y/o propanol.

La invención también proporciona un método para valorar la presencia o concentración de un analito que es una molécula no proteica en una muestra de ensayo, cuyo método comprende: (a) poner en contacto la muestra de ensayo con un reactivo de lisis para formar una mezcla de lisis, consistiendo el reactivo de lisis en un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol que tiene de dos a seis átomos de carbono, donde el nivel de glicol es de entre el 10% y el 40% del reactivo de lisis, donde se incluye al menos un alcohol que tiene cinco o menos carbonos en el reactivo de lisis o se añade a la mezcla de lisis, la razón de glicol a alcohol es de 4:1 a 1:4 y, tras... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar una muestra de ensayo para uso en un ensayo para un analito que es una molécula no proteica, cuyo método consiste en poner en contacto la muestra de ensayo con un reactivo de lisis para formar una mezcla de lisis, incluyendo el reactivo de lisis un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol que tiene de dos a seis átomos de carbono, donde el nivel de glicol es de entre el 10% y el 40% del reactivo de lisis; donde se incluye en el reactivo de lisis o se añade a la mezcla de lisis al menos un alcohol que tiene cinco o menos carbonos, la proporción entre glicol y alcohol es de 4:1 a 1:4 y, tras la adición del alcohol, la mezcla de lisis es una mezcla homogénea; el método no incluye el contacto de la muestra de ensayo o de la mezcla de lisis con un detergente; y la mezcla de lisis está lista para el análisis sin necesidad de una etapa de centrifugación.

2. Un método para valorar la presencia o concentración de un analito que es una molécula no proteica en una 15 muestra de ensayo, cuyo método consiste en:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con un reactivo de lisis para formar una mezcla de lisis, incluyendo el reactivo de lisis un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol que tiene de dos a seis átomos de carbono, donde el nivel de glicol es de entre el 10% y el 40% del

reactivo de lisis, donde se incluye el en reactivo de lisis o se añade a la mezcla de lisis al menos un alcohol que tiene cinco o menos carbonos, la proporción entre glicol y alcohol es de 4:1 a 1:4 y, tras la adición del alcohol, la mezcla de lisis es una mezcla homogénea; el método no incluye el contacto de la muestra de ensayo o de la mezcla de lisis con un detergente; y

la mezcla de lisis está lista para el análisis sin necesidad de una etapa de centrifugación; y

(b) estudiar la mezcla de lisis en cuanto al analito.

3. El método de la reivindicación 2, donde el ensayo consiste en un inmunoensayo.

4. El método de la reivindicación 2, donde el analito incluye un fármaco inmunosupresor seleccionado entre el grupo consistente en sirolimus, tacrolimus, everolimus, temsorolimus, zotarolimus y ciclosporina.

5. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde el alcohol está incluido en el reactivo de lisis.

6. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde la muestra de ensayo consiste en una muestra de sangre humana.

7. El método de la reivindicación 1 ó 2, donde el alcohol es seleccionado entre el grupo consistente en metanol, etanol y propanol.

8. El método de la reivindicación 5, donde la proporción entre glicol y alcohol es de 4:1 a 1:2.

9. El método de la reivindicación 5, donde la muestra de ensayo es añadida al reactivo de lisis en una proporción de 2:1 a 1:2.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el ensayo detecta un analito que está unido a una o más proteínas de unión en la muestra de ensayo, incluyendo el método adicionalmente el contacto de la muestra de ensayo o de la mezcla de lisis con un agente que libera el analito de dichas una o más proteínas de unión.

11. El método de la reivindicación 10, donde el agente compite con el analito por la unión a dichas una o más 50 proteínas de unión.

12. El método de la reivindicación 11, donde el analito consiste en un fármaco inmunosupresor y el agente consiste en un fármaco inmunosupresor diferente, aunque estructuralmente similar.

13. El método de la reivindicación 10, donde el agente incluye una proteasa que degrada dichas una o más proteínas de unión.

14. Una mezcla de reactivo de lisis constituida por:

una muestra de ensayo consistente en una muestra de sangre humana y que puede contener un analito que es una molécula no proteica; un reactivo de lisis que comprende: un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol que tiene de dos a seis átomos de carbono, donde el nivel de glicol es de entre el 10% y el 40% del reactivo de lisis; y al menos un alcohol que tiene cinco o menos carbonos, donde la proporción entre glicol y alcohol es de 4:1 a 1:4; donde la mezcla de reactivo de lisis es una mezcla homogénea; y la mezcla de reactivo de lisis no incluye un detergente y está lista para el análisis sin necesidad de una etapa de centrifugación.

15. La mezcla de reactivo de lisis de la reivindicación 14, donde el alcohol es seleccionado entre el grupo consistente en metanol, etanol y propanol.

16. La mezcla de reactivo de lisis de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, donde la proporción entre glicol y 15 alcohol es de 4:1 a 1:2.

17. La mezcla de reactivo de lisis de la reivindicación 14, donde la proporción entre la muestra de ensayo y el reactivo de lisis es de 2:1 a 1:2.

18. La mezcla de reactivo de lisis de cualquiera de las reivindicaciones 14-17, donde la mezcla de reactivo de lisis incluye adicionalmente un agente que libera el analito de una o más proteínas de unión en la muestra de ensayo.

19. La mezcla de reactivo de lisis de la reivindicación 18, donde el agente compite con el analito por la unión a dichas una o más proteínas de unión. 25

20. La mezcla de reactivo de lisis de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, donde el analito es un fármaco inmunosupresor y el agente consiste en un fármaco inmunosupresor diferente, aunque estructuralmente similar.

21. La mezcla de reactivo de lisis de la reivindicación 18, donde el agente incluye una proteasa que degrada dichas 30 una o más proteínas de unión.

22. Un kit de ensayo que comprende:

(a) al menos un anticuerpo o proteína capaz de unirse específicamente a al menos un analito que es una 35 molécula no proteica;

(b) un reactivo de lisis constituido por un glicol seleccionado entre el grupo consistente en etilenglicol, propilenglicol y un glicol que tiene de dos a seis átomos de carbono, donde el nivel de glicol es de entre el 10% y el 40% del reactivo de lisis; y

(c) al menos un alcohol que tiene cinco o menos carbonos, donde el reactivo de lisis y el/los alcohol (es) están 40 combinados y envasados en un solo recipiente y la proporción entre glicol y alcohol es de 4:1 a 1:4; donde:

el reactivo de lisis no incluye un detergente; y el reactivo de lisis, cuando se mezcla con una muestra de ensayo consistente en una muestra de sangre humana, forma una mezcla de reactivo de lisis que es una mezcla homogénea, y la mezcla de reactivo 45 de lisis está lista para el análisis sin necesidad de una etapa de centrifugación.

23. El kit de ensayo de la reivindicación 22, donde el analito consiste en un fármaco inmunosupresor seleccionado entre el grupo consistente en sirolimus, tacrolimus, everolimus, temsorolimus, zotarolimus y ciclosporina.

24. El kit de ensayo de la reivindicación 22, que adicionalmente incluye una composición de control que contiene el al menos un analito de (a) .

25. El kit de ensayo de la reivindicación 22, donde el alcohol es seleccionado entre el grupo consistente en metanol,

etanol y propanol. 55

26. El kit de ensayo de la reivindicación 22, donde la proporción entre glicol y alcohol es de 4:1 a 1:2.

27. El kit de ensayo de la reivindicación 22, donde el kit de ensayo incluye adicionalmente un agente que libera el

analito de una o más proteínas de unión en la muestra de ensayo. 60

28. El kit de ensayo de la reivindicación 27, donde el agente compite con el analito por la unión a dichas una o más proteínas de unión.

29. El kit de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 27 a 28, donde el analito es un fármaco inmunosupresor y el agente consiste en un fármaco inmunosupresor diferente, aunque estructuralmente similar.

30. El kit de ensayo de la reivindicación 27, donde el agente incluye una proteasa que degrada dichas una o más 5 proteínas de unión.

31. El kit de ensayo de la reivindicación 22 donde:

(a) el al menos un analito es al menos un fármaco inmunosupresor seleccionado entre el grupo consistente 10 en sirolimus, tacrolimus, everolimus, temsorolimus, zotarolimus y ciclosporina;

(b) el reactivo de lisis incluye propilenglicol y etanol en una proporción de 4:1 a 1:2; y

el kit de ensayo incluye además una composición de control que contiene el al menos un fármaco inmunosupresor de (a) .