Procedimiento para la purificación de un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y un contaminante,

comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a cabo de manera secuencial: a)unión del polipéptido a un material de intercambio iónico utilizando un tampón de carga, en donde el tampón de carga está a una primera conductividad y pH; b) lavado del material de intercambio iónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH para que eluya el contaminante del material de intercambio iónico; c) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH, en donde el cambio de conductividad y/o pH del tampón intermedio al tampón de lavado está en dirección opuesta al cambio en la conductividad y/o pH del tampón de carga al tampón intermedio; d) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH para que eluya el polipéptido del material de intercambio iónico.

Purificación de proteínas mediante cromatografía de intercambio iónico.

Campo técnico

La presente invención se refiere, de manera general, a la purificación de proteínas. La invención se refiere, en particular, a un procedimiento de purificación de un polipéptido (p.e. un anticuerpo) de una composición que comprende el polipéptido y por lo menos un contaminante, utilizando el procedimiento de cromatografía de intercambio iónico.

Antecedentes del estado de la técnica

La purificación a gran escala económica de proteínas se está convirtiendo en un problema importante en la industria biotecnológica. En general, las proteínas son producidas en cultivos celulares, utilizando líneas celulares de mamíferos o bacterias manipuladas genéticamente para producir la proteína de interés, mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Puesto que las líneas celulares utilizadas son organismos vivos, estos deben ser alimentados con un medio de crecimiento complejo que contenga azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, frecuentemente procedente de preparaciones de suero animal. Es un gran reto la separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos de alimento para las células y de los subproductos de las células con una pureza suficiente para ser utilizada como terapéutico humano.

Los procedimientos de purificación de proteínas procedentes de debris celulares dependen inicialmente del lugar de expresión de la proteína. Se pueden estimular algunas proteínas para que se secreten, de manera directa, de la célula al medio de crecimiento que la rodea; otras están producidas de manera intracelular. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un procedimiento de purificación implica la lisis de la célula, lo cual se puede realizar mediante una serie de procedimientos, incluyendo la agitación mecánica, el choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Dicho rompimiento libera los contenidos enteros de la célula en el homogenado y, además, produce fragmentos subcelulares que son difíciles de extraer debido a su pequeño tamaño. Estos se eliminan, generalmente, mediante centrifugación diferencial o filtración. El mismo problema se plantea, aunque a menor escala, con las proteínas que se secretan directamente, debido a la muerte natural de las células y a la liberación de las proteínas intracelulares de la célula hospedadora en el curso de la producción de la proteína.

Una vez se ha obtenido una solución clarificada que contenga la proteína de interés, se consigue su separación de las otras proteínas producidas por la célula utilizando, en general, una combinación de diferentes técnicas cromatográficas. Estas técnicas separan mezclas de proteínas basándose en su carga, grado de hidrofobicidad o tamaño. Son asequibles varias resinas de cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas, permitiendo una adaptación precisa del esquema de purificación para una determinada proteína implicada. La esencia de cada uno de estos procedimientos de separación es que se puede provocar que las proteínas eluyan a diferentes velocidades a lo largo de la columna, consiguiendo una separación física que aumenta a medida que pasan por la columna, o una adhesión, de manera selectiva, al medio de separación, siendo, a continuación, eluída, de manera diferencial, mediante diferentes disolventes. En algunos casos, se separa la proteína deseada de las impurezas cuando las impurezas se adhieren de manera específica a la columna y la proteína de interés no, esto es, la proteína de interés está presente en el flujo continuo.

La cromatografía de intercambio iónico es una técnica cromatográfica que se utiliza frecuentemente para la purificación de proteínas. En la cromatografía de intercambio iónico, los parches cargados en la superficie del soluto son atraídos por cargas contrarias de la matriz de cromatografía, con la condición de que la fuerza iónica del tampón circundante sea bajo. La elución se consigue, en general, incrementando la fuerza iónica del tampón (p.e. conductividad) para que compita con el soluto por los sitios cargados en la matriz de intercambio iónico. Otra manera de conseguir la elución del soluto es cambiando el pH y, por consiguiente, alterando la carga del soluto. El cambio en la conductividad o pH puede ser gradual (elución por gradiente) o escalonada (elución por etapas). En el pasado, estos cambios habían sido progresivos; es decir, el pH o la conductividad aumentaba o disminuía en una única dirección. La utilización de resinas de intercambio iónico en la purificación de proteínas se describe en Graf et al., Bioseparation 4: 7-20 (1994).

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento cromatográfico de intercambio iónico en donde un polipéptido de interés se une al material de intercambio iónico a una conductividad o pH inicial y, a continuación, se lava el material de intercambio iónico con un tampón intermedio a una conductividad o pH diferente, o ambas. En un momento determinado, después del lavado intermedio, y contrariamente a la práctica estándar en cromatografía de intercambio iónico, el material de intercambio iónico se lava con un tampón de lavado donde el cambio de conductividad o pH, o ambas, del tampón intermedio al tampón de lavado es en una dirección opuesta al cambio de conductividad o pH, o ambas, conseguido con las etapas anteriores. Solo después del lavado con el tampón de lavado el material de intercambio iónico está preparado para que la molécula polipeptídica de interés eluya mediante la aplicación del tampón de elución que tiene una conductividad o pH, o ambas, que difiere de la conductividad o pH, o ambas, de los tampones utilizados en las etapas anteriores.

Esta nueva aproximación a la cromatografía de intercambio iónico es particularmente útil en situaciones en las que una molécula de producto debe ser separada de una molécula contaminante relacionada muy cercana a escala completa de fabricación, donde se desea tanto pureza como una elevada recuperación del producto.

De acuerdo con esto, la invención proporciona un procedimiento para la purificación de un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y un contaminante, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a cabo de manera secuencial:

a)unión del polipéptido a un material de intercambio iónico utilizando un tampón de carga, en donde el tampón de carga está a una primera conductividad y pH;

b) lavado del material de intercambio iónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH para que eluya el contaminante del material de intercambio iónico;

c) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH, en donde el cambio de conductividad y/o pH del tampón intermedio al tampón de lavado está en dirección opuesta al cambio en la conductividad y/o pH del tampón de carga al tampón intermedio;

d) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH para que eluya el polipéptido del material de intercambio iónico. La primera conductividad y/o pH puede(n) ser igual(es) a la tercera conductividad y/o pH.

Cuando el material de intercambio iónico comprende una resina de intercambio catiónico, la conductividad y/o pH del tampón intermedio es/son preferiblemente mayor(es) que la conductividad y/o pH del tampón de carga; la conductividad y/o pH del tampón de lavado es/son preferiblemente menor(es) que la conductividad y/o pH del tampón intermedio; y la conductividad y/o pH del tampón de elución es/son preferiblemente mayor(es) que la conductividad y/o pH del tampón intermedio. Preferiblemente, la conductividad y/o pH del tampón de lavado es/son aproximadamente igual(es) a la conductividad y/o pH del tampón de carga.

Preferiblemente, la elución del contaminante y del polipéptido se consigue mediante modificación de la conductividad del tampón intermedio y del tampón de elución, respectivamente, mientras se mantiene el pH de estos tampones aproximadamente iguales.

La presente invención también proporciona un procedimiento para la purificación de un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y un contaminante, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a cabo de manera secuencial:

a)unión...

1. Procedimiento para la purificación de un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y un contaminante, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a cabo de manera secuencial:

a)unión del polipéptido a un material de intercambio iónico utilizando un tampón de carga, en donde el tampón de carga está a una primera conductividad y pH;

b) lavado del material de intercambio iónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH para que eluya el contaminante del material de intercambio iónico;

c) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH, en donde el cambio de conductividad y/o pH del tampón intermedio al tampón de lavado está en dirección opuesta al cambio en la conductividad y/o pH del tampón de carga al tampón intermedio;

d) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH para que eluya el polipéptido del material de intercambio iónico.

2. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde el material de intercambio iónico comprende una resina de intercambio catiónico.

3. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde el material de intercambio iónico comprende una resina de intercambio aniónico.

4. Procedimiento de la reivindicación 2 en donde la conductividad y/o pH del tampón intermedio es/son mayor(es) que la conductividad y/o pH del tampón de carga y la conductividad y/o pH del tampón de lavado es/son inferior(es) a la conductividad y/o pH del tampón intermedio.

5. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde la conductividad y/o pH del tampón de lavado es/son aproximadamente igual(es) a la conductividad y/o pH del tampón de carga.

6. Procedimiento de la reivindicación 2 en donde la conductividad y/o pH del tampón de elución es/son superior(es) a la conductividad y/o pH del tampón intermedio.

7. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde la elución del contaminante y del polipéptido se consigue mediante modificación de la conductividad del tampón intermedio y del tampón de elución, respectivamente.

8. Procedimiento de la reivindicación 7 en donde el pH permanece aproximadamente constante durante cada una de las etapas (a)-(d).

9. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde el polipéptido y el contaminante tienen pI que difieren en aproximadamente de 0,05 a 0,2 unidades de pI.

10. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde el contaminante es una variante desamidada del polipéptido.

11. Procedimiento de la reivindicación 7 en donde la conductividad del tampón intermedio y del tampón de elución se modifica mediante el cambio de la concentración de sal en la misma.

12. Procedimiento de la reivindicación 11 en donde la conductividad del tampón intermedio y del tampón de elución se modifica mediante el cambio de la concentración de NaCl en la misma.

13. Procedimiento de la reivindicación 1 que además comprende el lavado del material de intercambio iónico con un tampón de regeneración después de la etapa (d).

14. Procedimiento de la reivindicación 2 en donde la resina de intercambio catiónico comprende sulfopropil inmovilizado en agarosa.

15. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde el polipéptido es un anticuerpo.

16. Procedimiento de la reivindicación 15 en donde el anticuerpo se une a HER2.

17. Procedimiento de la reivindicación 1 en donde el contaminante es una variante desamidada del polipéptido.

18. Procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además someter la composición que comprende el polipéptido a una o más etapas de purificación ya sean antes, durante o después del procedimiento de cromatografía de intercambio iónico así como para obtener una preparación homogénea del polipéptido.

19. Procedimiento de la reivindicación 18 que comprende además la conjugación del polipéptido purificado con una molécula heteróloga.

20. Procedimiento de la reivindicación 19 en donde la molécula heteróloga es polietilenglicol, un marcador o un agente citotóxico.

21. Procedimiento de la reivindicación 18 que comprende además la preparación de una composición farmacéutica mediante la combinación de la preparación homogénea del polipéptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Procedimiento para la purificación de un anticuerpo de una composición que comprende el anticuerpo y un contaminante, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a cabo de manera secuencial:

a)unión del polipéptido a un material de intercambio catiónico utilizando un tampón de carga, en donde el tampón de carga está a una primera conductividad y pH;

b) lavado del material de intercambio catiónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH que es mayor que la(s) del tampón de carga para que eluya el contaminante del material de intercambio iónico;

c) lavado del material de intercambio catiónico con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH que es menor que la del tampón intermedio;

d) lavado del material de intercambio catiónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH que es mayor que la del tampón intermedio con el fin de que eluya el polipéptido del material de intercambio iónico.