PROTEINAS OLIGOMERICAS Y SUS APLICACIONES.

Las proteínas oligoméricas comprenden una pluralidad de proteínas de fusión y un marcador,

comprendiendo cada proteína de fusión un polipéptido que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, y un polipéptido que comprende un dominio de oligomerización. Dichas proteínas oligoméricas pueden utilizarse para detectar, visualizar y localizar dianas de interés.

Proteínas oligoméricas y sus aplicaciones.

Campo de la invención La invención se relaciona con una proteína oligomérica que comprende una pluralidad de proteínas de fusión, iguales o diferentes, y un marcador, en la que cada proteína de fusión comprende un polipéptido que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo, y un polipéptido que comprende un dominio de oligomerización. Dichas proteínas oligoméricas pueden ser utilizadas para detectar, visualizar y localizar dianas de interés.

Antecedentes de la invención Los procedimientos de imagen en medicina se refieren a técnicas y procesos no invasivos usados para crear imágenes del aspecto interno del cuerpo de un animal, para propósitos clínicos, por ejemplo, procedimientos médicos para diagnosticar una enfermedad o para localizar dicha enfermedad. En un sentido amplio, incluye técnicas tales como ciencias radiológicas, endoscopia, termografía médica y microscopía. Tradicionalmente, los estudios de laboratorio para evaluar la actividad de las terapias anticancerígenas en ratones han requerido el sacrificio de múltiples animales en cada etapa para proporcionar datos significativos. Las técnicas de imagen, sin embargo, permiten una evaluación precisa del crecimiento tumoral y a tiempo real en animales de laboratorio, lo que disminuye de forma considerable el número de sujetos requeridos.

La tomografía por emisión de positrones, TEP o PET (por las siglas en inglés de Positron Emission Tomography) es una técnica propia de una especialidad médica llamada medicina nuclear y de la radiología, al combinar imágenes de TAC (ejemplos de imágenes 3D) . Se trata de una técnica no invasiva de diagnóstico e investigación por imagen capaz de medir la actividad metabólica de los diferentes tejidos del cuerpo humano, especialmente del sistema nervioso central. Al igual que el resto de técnicas diagnósticas en Medicina Nuclear, la TEP se basa en detectar y analizar la distribución que adopta en el interior del cuerpo un radioisótopo administrado a través de una inyección. La TEP permite, por ejemplo, localizar los focos de crecimiento celular anormal en todo el organismo, en un solo estudio e independientemente de la localización anatómica donde se presente la neoplasia (primaria o metastásica) , ya que la TEP no evalúa la morfología de los tejidos, sino su metabolismo. Por tanto, se ha implantado con mucha fuerza como técnica diagnóstica en oncología, además de otras áreas, como son la cardiología, la neurología y la psicobiología, dada la posibilidad de cuantificar el metabolismo tanto cardiaco como en el sistema nervioso central.

La técnica de fluorescencia es una técnica de imagen que permite estudiar las propiedades de sustancias orgánicas o inorgánicas utilizando el fenómeno de fluorescencia. En la mayoría de los casos, se marca específicamente un componente de interés en la muestra, con una molécula fluorescente llamada fluoróforo. La muestra se ilumina con luz de una determinada/s longitud/es de onda, que es absorbida por los fluoróforos, originando una emisión de luz a longitudes de onda mayores (o a diferente color que la luz absorbida) . La cantidad y la longitud de onda de la energía emitida dependen del fluoróforo y del entorno químico del fluoróforo. Entre los fluoróforos más comúnmente utilizados se encuentran la fluoresceína isotiocianato (FITC) , los derivados de la rodamina (TRITC) , comarina y cianina, los fluoróforos “Alexa Fluor” y “DyLight Fluor”, la familia de la cianina (e.g., Cy3, Cy5 y Cy7) .

La técnica de imagen por fluorescencia in vivo es igual que la microscopía de fluorescencia, difiere únicamente en que trabaja a nivel macroscópico. Los objetos para imagen por fluorescencia son el cuerpo completo de (pequeños) animales. Moléculas que absorben en la región del infrarrojo cercano (NIR) , 700-1.000 nm, pueden ser utilizadas para visualizar e investigar dianas moleculares in vivo, ya que la mayoría de los tejidos generan poca fluorescencia NIR. Los fluoróforos orgánicos NIR más comunes son las polimetinas (e.g., pentametina y heptametina) . Las sondas utilizadas para imagen por fluorescencia in vivo pueden ser dirigidas o no dirigidas. Las dirigidas tienen la ventaja de que se pueden dirigir específicamente a un tejido diana. De esta manera, las sondas se unen a sus dianas, mientras que las no unidas se eliminan de la circulación. Esta aproximación es muy útil para realizar imágenes de tumores in vivo, ya que en cáncer, normalmente se sobreexpresan ciertos receptores de superficie. Un ejemplo de sondas dirigidas pueden ser moléculas de anticuerpos conjugadas con cianinas o “quantum dots”. También se pueden utilizar moléculas más pequeñas dirigidas, en lugar de anticuerpos, por ejemplo ácido fólico conjugado con un fluorocromo NIR que proporciona imágenes de macrófagos activados implicados en enfermedades inflamatorias de articulaciones. Dichas moléculas irían dirigidas al receptor de ácido fólico. Dentro del grupo de las sondas dirigidas, los anticuerpos presentan la ventaja de su rápido aislamiento y que tienen una alta afinidad por virtualmente, cualquier antígeno.

Por otra parte, diferentes ensayos sistemáticos in vivo han proporcionado una confirmación de que el tamaño es un parámetro importante en farmacocinética y biodistribución de moléculas de anticuerpos monoclonales. Así, parece ser que moléculas grandes de IgG (150 kDa) que reconocen antígenos de superficie expresados por las células tumorales penetran en los tumores sólidos muy lentamente, con una distribución no uniforme, y tienen una vida media sérica muy larga [Holliger et al. Nature Biotec. 2005; 23: 1126-36]. Por el contrario, pequeños fragmentos de anticuerpo de cadena única (scFv) monovalentes, con un tamaño de 25-30 kDa son mucho más eficientes en la penetración al tumor, pero son eliminados demasiado rápido y poseen además una pobre retención en el tumor, debido a sus propiedades de unión monovalente.

Un anticuerpo ideal para localizar tumores debería ser una molécula multivalente de tamaño intermedio, que proporcione una penetración más rápida en el tumor, una mayor retención en el tejido diana y una eliminación sanguínea más rápida. Estudios recientes indican que anticuerpos bivalentes, tales como los “diabodies” (60 kDa) , pueden ser más apropiados para las técnicas de imagen [Williams et al., 2001; Cancer Biother. Radiopharm.; 16:25-35]. Los “diabodies” son moléculas diméricas no unidas covalentemente, formadas espontáneamente en formato scFv con espaciadores cortos que conectan la región variable de los genes. Debido a su pequeño tamaño, se eliminan rápidamente a través de los riñones, limitando, por tanto, su exposición a la médula ósea, que es frecuentemente el órgano dosis-limitante con los anticuerpos intactos radiomarcados. Moléculas más grandes bivalentes, tales como los “minibodies” (dímeros scFv-CH3) y scFv2-Fc se pueden acumular en tumores y estos últimos pueden diseñarse con un espectro amplio de vidas medias en suero, modulando la interacción con el receptor FcRn. Los “minibodies” pueden ser ideales para localizar tumores, ya que penetran mejor y tienen una eliminación rápida con lo que consiguen mejores proporciones tumor-sangre que las inmunoglobulinas intactas (150 kDa) o los fragmentos Fab2 (110 kDa) .

Sin embargo, a pesar de los buenos resultados obtenidos con estos formatos en varios modelos [Williams et al., 2001; Cancer Biother. Radiopharm.; 16:25-35 y Adams et al., 1998; Br. J. Cancer 77:1405-12], aún existen algunas limitaciones que necesitan ser solucionadas con el fin de obtener las mayores ventajas de la capacidad de localización de estos anticuerpos recombinantes. Una de las limitaciones es su limitada flexibilidad, y, otra, la necesidad de que el segundo antígeno esté orientado de manera precisa en un área estrictamente definida una vez que el anticuerpo se una al primer antígeno. De esta manera, los antígenos unidos deberían encontrarse casi opuestos al “diabody”, y en el caso del “minibody”, en una pequeña área circular, que, en algunos casos impide la unión del segundo antígeno. Esto implica que parte de la afinidad observada depende principalmente de la unión y de la capacidad de volverse a unir (“rebinding”) , y no de la unión simultánea a diferentes moléculas del antígeno.

Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar reactivos para diagnóstico por imagen, basados en anticuerpos, que permitan la detección, visualización o localización de una diana de interés, tal como un antígeno asociado con una alteración patológica, que superen... [Seguir leyendo]

1. Una proteína oligomérica que comprende una pluralidad de proteínas de fusión, iguales o diferentes, y un marcador (M) , en la que cada proteína de fusión comprende:

(a) un polipéptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo; y

(b) un polipéptido (B) que comprende un dominio de oligomerización.

2. Proteína oligomérica según la reivindicación 1, en la que dicho marcador (M) es un fluoróforo o un radionucleido.

3. Proteína oligomérica según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido (A) comprende un anticuerpo que reconoce una diana, o un fragmento funcionalmente equivalente de dicho anticuerpo que reconoce una diana, en donde dicha diana es un epítopo o determinante antigénico de un antígeno.

4. Proteína oligomérica según la reivindicación 3, en la que dicho antígeno es un antígeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteración patológica.

5. Proteína oligomérica según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido (A) comprende un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento Fab, F (ab’) 2 o Fab’, un fragmento Fv de cadena única (scFv) , un diabody o un anticuerpo monodominio (VHH) .

6. Proteína oligomérica según la reivindicación 1, en la que dicho dominio de oligomerización presente en dicho polipéptido (B) comprende el dominio NC1 de colágeno XVIII o del colágeno XV de mamífero, opcionalmente desprovisto total o parcialmente del dominio de endostatina (ES) .

7. Proteína oligomérica según la reivindicación 1, constituida por 2 ó más proteínas de fusión, iguales o diferentes.

8. Un procedimiento para la obtención de una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende poner en contacto una proteína oligomérica que comprende una pluralidad de proteínas de fusión, iguales o diferentes, en la que cada proteína de fusión comprende:

i) un polipéptido (A) que comprende un anticuerpo o un fragmento funcionalmente equivalente del mismo; y

ii) un polipéptido (B) que comprende un dominio de oligomerización,

con un marcador (M) bajo condiciones que permiten la unión de dicho marcador (M) a la proteína oligomérica.

9. Empleo de una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en un método para la detección, visualización o localización de una diana.

10. Empleo según la reivindicación 9, en el que dicha diana es un antígeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteración patológica.

11. Un método para la detección, visualización o localización de una diana que comprende el empleo de una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones1a7.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho método se basa en una técnica de imagen.

13. Método según la reivindicación 11, en el que dicha diana es un antígeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteración patológica.

14. Una composición que comprende una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, junto con, al menos, un medio apropiado.

15. Una composición farmacéutica que comprende una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones1a7, junto con, al menos, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Un kit que comprende una proteína oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones1a7.

17. Empleo de un kit según la reivindicación 16, para la detección, visualización o localización de una diana.

18. Empleo según la reivindicación 17, en el que dicha diana es un antígeno que se expresa de novo o se sobreexpresa en una alteración patológica.