Proteína de la cápside del virus del Dengue que induce una respuesta protectora y su composición farmacéutica.

En esta invención se describe la obtención de un compuesto farmacéutico que contiene la proteína de la cápsida de los serotipos del virus Dengue capaz de inducir en el receptor una respuesta inmune protectora frente al reto viral,

sin inducir el fenómeno de inmunoamplificación dependiente de Acs.

Proteína de la cápside del virus del Dengue que induce una respuesta protectora y su composición farmacéutica.

El ámbito de la presente invención se define por las reivindicaciones y cualquier información que no se encuentre en las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo.

La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología y la industria farmacéutica, en particular con la obtención de proteínas capaces de inducir una respuesta inmune contra la infección por el virus del Dengue, citado a partir de aquí como DEN, evitando el fenómeno de activación dependiente de anticuerpos descrito en personas reinfectadas con el virus.

El dengue febril (DF) y el dengue hemorrágico febril (DHF) están siendo cada vez más importantes como problemas sanitarios, afectando a muchos países de las zonas tropical y subtropical de nuestro planeta. El virus del dengue se ha reconocido en más de 100 países y se estima que 2.500 millones de personas viven en áreas de riesgo. Se han comunicado entre 50 y 100 millones de casos de DF y de 250.000 a 500.000 de DHF cada año. (Guzman M.G. y Kouri G. 2002. Dengue: an update. Lancet Infect. Dis. 2: 33-42) .

El agente causal de esta enfermedad es el virus del Dengue, que pertenece a la familia Flaviviridae, género Flavivirus, que se transmite por el mosquito Aedes aegypti (Leyssen P., De Clerco E., Neyts J. 2000. Perspectives for the treatment of infections with Flaviviridae. Clin. Microbiol. Rev. 13: 67-82) .

Hasta ahora se ha informado de cuatro serotipos que pueden circular en la misma región. El virus del dengue es un virus encapsulado ARN positivo, cuyo genoma contiene una fase de lectura simple que se traduce en una poliproteína que se procesa en tres proteínas estructurales y siete proteínas no estructurales. (Russell P.K., Brandt W.E., Dalr y mple J.M. 1980. Chemical and antigenic structure of flaviviruses. The togaviruses: biology, structure, replication. Schelesinger R.W. (ed.) . 503-529) .

Se han hecho múltiples estudios para determinar los factores de riesgo que están implicados en la forma más grave de la enfermedad del dengue, que se caracterizan por fiebre alta, extravasación de fluidos, hemorragias y último término choque por dengue. (Gubler D.J. 1998. Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. Clin. Microbiol. Rev. 11: 480-496) . Uno de los factores de riesgo más importantes es la infección secundaria por un serotipo heterólogo, debido a que no hay protección cruzada entre infecciones de diferentes serotipos. (Kouri G., Guzman M.G., Bravo J., Trina C. 1989. Dengue hemorrhagic fever/ dengue shock syndrome: lessons from the Cuban epidemic. WHO Bulletin OMS. 67: 375-380) .

Existen varias hipótesis para explicar este fenómeno, entre ellas está la de amplificación dependiente de anticuerpo. (Halstead S.B., Scanlon J.E., Umpaivit P., Udomsakdi S. 1969. Dengue and Chikungunya virus infection in man in Thailand, 1962-1964. IV. Epidemiologic studies in the Bangkok metropolitan area. Am. J. Trop. Med. Hyg. 18: 9971021) .

Estudios anteriores sugieren que el virus DEN se replica más en las células mononucleares de la sangre periférica de los pacientes cuando han tenido una infección previa con este virus (Halstead S.B., O’Rourke E.J., Allison A.C. 1977. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. II. Identity of blood and tissue leukocytes supporting in vitro infection. J. Exp. Med. 146: 218-229) . Posteriormente, se ha demostrado que los anticuerpos residuales pueden ser los responsables de este efecto (Morens DM, Halstead SB, Marchette NJ. 1987. Profiles of antibody-dependent enhancement of dengue virus type 2 infection. Microb Pathog. Oct; 3 (4) :231-7) .

Bajo condiciones de especificidad o concentración de anticuerpos en las cuales no se produce la neutralización, los complejos virus-anticuerpo pueden incorporarse en las células que expresan receptores FCy en las membranas, tales como monocitos y macrófagos. Este mecanismo, conocido como amplificación dependiente de anticuerpo (ADA) se produce durante las infecciones secundarias. (Morens DM, Halstead SB, Marchette NJ. 1987. Profiles of antibody-dependent enhancement of dengue virus type 2 infection. Microb Pathog. Oct;3 (4) : 231-7; Kliks S.C., Nimmannitya S., Nisalak A., Burke D.S. 1988. Evidence that maternal dengue antibodies are important in the development of dengue hemorrhagic fever in infants. Am. J. Trop. Med. Hyg. 38: 411-419) .

Halstead y col. (Halstead S.B., Scanlon J.E., Umpaivit P., Udomsakdi S. 1969. Dengue and Chikungunya virus infection in man-in Thailand, 1962-1964. IV. Epidemiologic studies in the Bangkok metropolitan area. Am. J. Trop. Med. Hyg. 18: 997-1021.) , en un estudio de 3 años en Bangkok, Tailandia, informa de que las tasas de hospitalización por infección por DEN entre niños alcanzaba el máximo entre los 7 y 8 meses de edad. Estas tasas eran cuatro a ocho mayores que las observadas entre niños de 1-3 meses y dos veces la de niños menores de 3 años. Kliks y col. (Kliks S.C., Nimmannitya S., Nisalak A., Burke D.S. 1988. Evidence that maternal dengue antibodies are important in the development of dengue hemorrhagic fever in infants. Am. J. Trop. Med. Hyg. 38: 411419) , determinaron la relación entre los títulos de anticuerpos neutralizantes maternos contra DEN-2 y la edad en trece niños con DFH causado por el virus homólogo. Los resultados mostraron que los casos graves de infección por el virus se producían cuando los niveles de los anticuerpos maternos disminuían hasta niveles subneutralizantes.

Estos datos están en consonancia con la hipótesis de que los anticuerpos maternos tienen un doble papel protegiendo inicialmente y después estimulando el desarrollo de DHF.

A pesar de la existencia de este fenómeno inmunológico, hoy en día los candidatos vacunales más avanzados en todo el mundo están basados en cepas víricas atenuadas de los cuatro diferentes serotipos que contienen la proteína de envoltura. Estos candidatos son potencialmente capaces de inducir anticuerpos inmunoestimulantes contra las proteínas expuestas (PrM/M y proteínas de envoltura) y anticuerpos neutralizantes protectores contra los cuatro serotipos víricos (Kanesathasan N., Sun W., Kim-Ahn G., Van Albert S., Putnak J. R., King A., Raengsakulsrach B., Christ-Schmidt H., Gilson K., Zahradnik J.M., Vaughn D.W., Innis B.L., Saluzzo J.F. y Hoke C.H. 2001. Safety and immunogenicity of attenuated dengue virus vaccines (Aventis Pasteur) in human volunteers. Vaccine. 19: 3179-3188) .

Si se pudiera conseguir la inducción de altos niveles de anticuerpos neutralizantes por inmunización, podría prevenirse la replicación vírica a pesar de la inducción de anticuerpos activadores. El problema se puede producir cuando no se alcanza la seroconversión completa de los cuatro serotipos en las vacunas en términos de anticuerpos neutralizantes o cuando con el paso del tiempo los anticuerpos declinan a niveles sanguíneos bajos y los individuos se convierten entonces en susceptibles a una infección secundaria grave con un serotipo vírico para el que no están presentes anticuerpos protectores. De hecho, se han realizado varios ensayos en monos y seres humanos para definir las cantidades víricas en las formulaciones vacunales. (Guirakhoo F., Arroyo J., Pugachev K.V., Miller C., Zhang Z. X., Weltzin R., Georgakopoulos K., Catalan J., Ocran S., Soike K., Raterree M., Monath T.P. 2001. Construction, safety, and immunogenicity in nonhuman primates of a chimeric yellow fever-dengue virus tetravalent vaccine. J. Virol. 75: 7290-7304) .

En algunos casos no se alcanzaba una seroconversión equilibrada contra los cuatro serotipos (Sabchareon A, Lang J, Chanthavanich P, Yoksan S, Forrat R, Attanath P, Sirivichayakul C, Pengsaa K, Pojjaroen-Anant C, Chokejindachai W, Jagsudee A, Saluzzo JF, Bhamarapravati N. 2002. Safety and immunogenicity of tetravalent liveattenuated dengue vaccines in Thai adult volunteers: role of serotype concentration, ratio, and multiple doses. Am J Trop Med Hyg. 66 (3) : 264-72) . Además, es necesario administrar hasta 3 dosis de vacuna atenuada en niños para una seroconversión completa en términos de anticuerpos neutralizantes y hace falta ver si estos perdurarán (Sabchareon A, Lang J, Chanthavanich P, Yoksan S, Forrat R, Attanath P, Sirivichayakul C, Pengsaa K, Pojjaroen-Anant C, Chambonneau L, Saluzzo JF, Bhamarapravati N..2004. Safety and immunogenicity of a three dose regimen of two tetravalent live-attenuated dengue vaccines in five- to twelve-year-old Thai children. Pediatr Infect Dis J.;23 (2) :99-1 09) . Este es actualmente uno de los aspectos más cuestionados en las formulaciones que incluyen la proteína de envoltura del virus del Dengue, y consecuentemente en los candidatos vacunales en desarrollo.... [Seguir leyendo]

1. Una preparación farmacéutica caracterizada por ser una vacuna, conteniendo dicha vacuna como antígeno inmunizante la proteína de cápside de uno o varios serotipos del virus del Dengue en una forma recombinante para su uso en un procedimiento de inducción de una respuesta inmunitaria protectora contra el virus del Dengue en el organismo receptor por activación inmunológica, donde dicha activación inmunológica es el aumento de inducción de anticuerpos antivíricos específicos de serotipo en un sujeto por un antígeno Dengue heterólogo.

2. Una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación1 para su uso en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho antígeno Dengue heterólogo es el dominio III de la proteína de envoltura de un virus del Dengue.

3. Una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada por que contiene la proteína de cápside del virus del Dengue 1, 2, 3 o 4, sola, mezclada o combinadas entre ellas.

4. Una preparación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que contiene la proteína de cápside mezclada o combinada con antígenos capaces de inducir una respuesta humoral y/o celular.

5. Una preparación de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 para su uso en el procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, caracterizada por que contiene la proteína de cápside mezclada con una o varias proteínas identificadas en la lista de secuencias como Secuencia ID. Nº 20, Secuencia ID. Nº 21, Secuencia ID. Nº 22 y Secuencia ID. Nº 23.

6. Una preparación de acuerdo con las reivindicaciones 1-5 para su uso en el procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, caracterizada por que contiene la proteína de cápside fusionada química o genéticamente con una o varias secuencias identificadas en la lista de secuencias como Secuencia ID. Nº 17, Secuencia ID. Nº 18, Secuencia ID. Nº 19 y Secuencia ID. Nº 24.

7. Una preparación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para su uso en el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 caracterizada por que contiene la proteína de cápside en forma agregada o particulada.

8. Una preparación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 1-7 para su uso en el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizada por que contiene un vehículo farmacológicamente aceptable y un adyuvante oleoso o no oleoso.

9. Una preparación farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 1-8 para su uso en el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 caracterizada por que es un agente preventivo o terapéutico contra el virus del Dengue, por uso vía oral, intramuscular, subcutánea, mucosa o intravenosa.