Promotores que muestran especificidad por células endoteliales y métodos de utilización de los mismos.

Un polinucleótido que comprende:

(a) un promotor funcional en células endoteliales;

(b) un elemento regulador que contiene al menos una copia de la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 8 ola secuencia complementaria de la misma conectada operablemente a dicho promotor, y

(c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un factor inductor de apoptosis bajo el control regulador dedicho promotor y dicho elemento regulador.

Promotores que muestran especificidad por células endoteliales y métodos de utilización de los mismos Campo y antecedentes de la invención La presente descripción hace referencia a secuencias de polinucleótidos aisladas que muestran una actividad promotora específica de las células endoteliales, y los métodos de utilización de las mismas y, más concretamente, a un promotor de preproendotelina-1 (PPE-1) modificado que muestra un incremento de actividad y especificidad en las células endoteliales. La descripción hace referencia adicionalmente a modificaciones del promotor de PPE que intensifican su expresión en respuesta a las condiciones fisiológicas incluyendo hipoxia y angiogénesis.

La terapia génica es una modalidad emergente para el tratamiento de enfermedades humanas heredadas y adquiridas. Se han dirigido grandes esfuerzos al desarrollo de métodos para la terapia génica del cáncer, las enfermedades cardiovasculares y vasculares periféricas, pero todavía existe un obstáculo principal en la liberación eficaz y específica de los genes. En general, el principal factor limitante de la terapia génica con un gen de interés utilizando un vector viral recombinante como lanzadera es la capacidad para dirigir específicamente el gen de interés al tejido diana. Los adenovirus que se utilizan para este fin son capaces de infectar una gran variedad de células con diferentes afinidades. En efecto, la utilización de un promotor no específico del tejido induce hasta 95% de la expresión del gen de interés en el hígado; por lo tanto es muy requerida la regulación de la expresión. Adicionalmente, actualmente no es viable diferenciar entre el endotelio vascular normal y el endotelio vascular en desarrollo en un tumor en crecimiento cuando se redirecciona un gen.

Tanto en el desarrollo del cáncer como en las enfermedades vasculares, la angiogénesis, creación de nuevos vasos, juega un papel principal. Por lo tanto, la regulación de este proceso por medio de terapia génica para el endotelio vascular puede ser tremendamente importante en la inducción de una terapia dirigida para estas enfermedades.

Se obtuvo una elevada eficacia de la preproendotelina-1 humana (PPE-1) , liberada por un vector retroviral, en células endoteliales (CE) in vitro, y en modelos de animales transgénicos. Sin embargo, la técnica anterior no ilustra el uso de este promotor para la terapia génica in vivo. La PPE-1 humana carece de los elementos reguladores encontrados en los genes de PPE-1 de otros animales, muy notablemente de ratón.

La patente de los Estados Unidos 5.747.340 ilustra el uso del promotor de PPE-1 murino y porciones del mismo. Sin embargo, esta patente no contiene indicios o sugerencias de que se pueda emplear un intensificador específico endotelial para incrementar el nivel de expresión logrado con el promotor de PPE a la vez que se conserva la especificidad endotelial. Adicionalmente, esta patente no ilustra que el promotor de PPE-1 sea inducido a niveles más altos de transcripción en condiciones hipóxicas.

Existe por lo tanto una necesidad ampliamente reconocida de, y sería muy ventajoso tener, un promotor específico de células endoteliales mejorado, métodos de uso del mismo y células transformadas con el mismo desprovistas de las limitaciones anteriores. Se espera que la invención descrita demuestre una utilidad añadida en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares, el cáncer y la curación de heridas con respecto a las configuraciones previamente conocidas.

Compendio de la invención De acuerdo con un aspecto de la presente descripción se proporciona un polinucleótido aislado funcional como promotor en células eucarióticas. El polinucleótido aislado incluye un elemento intensificador que incluye al menos dos copias de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción se proporciona un método de expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés, que codifica una molécula de ARN activa o una proteína tal como una enzima, una molécula informadora, y similares, en las células endoteliales. El método incluye administrar a un sujeto un constructo que incluye la secuencia de ácido nucleico de interés situada bajo el control regulador de un promotor funcional en células eucarióticas. El constructo incluye adicionalmente un elemento intensificador que incluye al menos una copia de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente descripción se proporciona un método de regulación de la angiogénesis en un tejido. El método incluye administrar un constructo de ácido nucleico que incluye: (a) un promotor específico de células endoteliales; (b) al menos una copia de un elemento de respuesta a hipoxia mostrado en el SEQ ID NO: 5; y (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de la angiogénesis, estando la secuencia de ácido nucleico bajo el control regulador del promotor y el elemento de respuesta a hipoxia.

De acuerdo con otro aspecto de la presente descripción se proporciona un polinucleótido aislado funcional como promotor en células eucarióticas. El polinucleótido aislado incluye un elemento intensificador que incluye la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 7.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente descripción se proporciona un método de regulación de la angiogénesis en un tejido. El método incluye administrar un constructo de ácido nucleico que incluye: (a) un promotor específico de células endoteliales; (b) un elemento intensificador que incluye la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 7; (c) al menos una copia de un elemento de respuesta a hipoxia mostrado en el SEQ ID NO: 5; y (d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de la angiogénesis, estando la secuencia de ácido nucleico bajo el control regulador del promotor, el elemento intensificador y el elemento de respuesta a hipoxia.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado funcional como promotor en células eucarióticas, el polinucleótido aislado incluye un elemento intensificador que incluye al menos una copia de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 8.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente descripción se proporciona un método de expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en células endoteliales, incluyendo el método administrar a un sujeto un constructo, incluyendo el constructo la secuencia de ácido nucleico de interés situada bajo el control regulador de un promotor funcional en células eucarióticas, y un elemento intensificador que incluye al menos una copia de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 8.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención se proporciona un polinucleótido aislado funcional como promotor en células eucarióticas, incluyendo el polinucleótido aislado un elemento intensificador que incluye la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 8.

De acuerdo con características adicionales de las realizaciones preferidas de la descripción descritas más abajo, el elemento intensificador incluye tres copias de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con otras características adicionales de las realizaciones preferidas de la descripción, las al menos dos copias de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 6 son contiguas.

De acuerdo con otras características adicionales de las realizaciones preferidas de la descripción, el polinucleótido aislado incluye adicionalmente un elemento promotor específico endotelial.

De acuerdo con otras características adicionales de las realizaciones preferidas de la descripción, el elemento promotor específico endotelial incluye al menos una copia del promotor de PPE-1.

De acuerdo con otras características adicionales de las realizaciones preferidas de la descripción, el polinucleótido aislado incluye adicionalmente un elemento de respuesta a hipoxia.

De acuerdo con otras características adicionales de las realizaciones preferidas de la invención, el elemento de respuesta a hipoxia incluye al menos una copia de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 5.

De acuerdo con otras características adicionales de las realizaciones preferidas de la invención, el elemento intensificador es como se muestra en el SEQ ID NO: 7.

De acuerdo con otras características adicionales de las realizaciones preferidas de la invención, se proporciona un constructo de ácido nucleico que incluye un polinucleótido aislado reivindicado y una secuencia de ácido nucleico de interés, estando la secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control regulador del polinucleótido aislado.

De acuerdo con... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que comprende:

(a) un promotor funcional en células endoteliales;

(b) un elemento regulador que contiene al menos una copia de la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 8 o 5 la secuencia complementaria de la misma conectada operablemente a dicho promotor, y

(c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un factor inductor de apoptosis bajo el control regulador de dicho promotor y dicho elemento regulador.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en donde dicho factor inductor de apoptosis es un gen pro-apoptótico.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho elemento regulador incluye adicionalmente al menos 10 una copia de la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 6 o la secuencia complementaria de la misma.

4. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho promotor funcional en células endoteliales comprende un promotor de prepro-endotelina-1 (PPE-1) .

5. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente un elemento de respuesta a la hipoxia que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 5.

6. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho elemento regulador es la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 7 o la secuencia complementaria de la misma.

7. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende el promotor de PP-1-3X, en donde dicho promotor comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en el SEQ ID NO: 1 y dicho elemento regulador comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en el SEQ ID NO: 7 o la secuencia complementaria de la misma.

8. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde dicho gen pro-apoptótico se selecciona del grupo que consiste en una timidina quinasa de Herpes simplex, una angiostatina, p55, una endostatina y una quimera de angiostatina-endostatina.

9. Un constructo de ácido nucleico que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 25 10. El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 9, en donde dicho constructo es un vector de adenovirus.

11. El constructo de ácido nucleico de la reivindicación 10, en donde dicho vector de adenovirus es un vector de Ad5.

12. Una célula de mamífero transformada con el constructo de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

13. El constructo de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para su uso en la inhibición de la angiogénesis en un sujeto que lo necesite.

14. El constructo de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para su uso en la inhibición de la angiogénesis en una masa tumoral de un sujeto que lo necesite.

15. Un vector de adenovirus recombinante que comprende:

(a) un polinucleótido que comprende un elemento intensificador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en el SEQ ID NO: 7 o la secuencia complementaria de la misma.

(b) un promotor de PPE-1 funcional en células endoteliales como se expone en el SEQ ID NO: 1;

(c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un factor inductor de apoptosis bajo el control de dicho promotor; y

(d) un elemento de respuesta a hipoxia como se expone en el SEQ ID NO: 5, en donde dicho vector de adenovirus es un vector de serotipo 5 de Ad.

16. El vector de adenovirus de la reivindicación 15, en donde dicho elemento inductor de apoptosis es un gen proapoptótico.

17. El vector de adenovirus de la reivindicación 15 o 16, para su uso en la inhibición de la angiogénesis en un tejido 45 endotelial de un sujeto que lo necesite.

18. El vector de adenovirus de la reivindicación 17, en donde dicho tejido es una masa tumoral.