PROMOTORES QUE EXHIBEN ESPECIFICIDAD POR CELULAS ENDOTELIALES Y METODOS PARA SU UTILIZACION.

Un polinucleótido aislado que funciona como un elemento regulador,

el polinucleótido aislado comprendiendo al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8, siendo dicho elemento regulador capaz de regular la expresión de una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor funcional en células endoteliales

Promotores que exhiben especificidad por células endoteliales y métodos para su utilización.

La presente invención se relaciona con un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 8, 31, con una célula de mamífero de acuerdo de acuerdo con las reivindicaciones 10, 33, con el uso de un promotor funcional en células endoteliales de acuerdo con la reivindicación 11, con el uso de una construcción de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 20, 34, 38, con un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 26.

La presente invención se relaciona con secuencias aisladas de polinucleótido que exhiben actividad promotora específica de células endoteliales, y métodos para su uso y, más particularmente con un promotor de preproendotelina-1 modificada (PPE-1) que exhibe mayor actividad y especificidad en células endoteliales. La invención se relaciona además con modificaciones del promotor PPE que mejora su expresión en respuesta a condiciones fisiológicas incluidas hipoxia y angiogénesis.

La terapia génica es una modalidad emergente para el tratamiento de enfermedades humanas adquiridas y heredadas. Se dirigen grandes esfuerzos al desarrollo de métodos para la terapia génica del cáncer, enfermedades vasculares periféricas y cardiovasculares, pero existe aún un obstáculo importante para el suministro de genes efectivos y específicos. En general, el factor limitante principal de la terapia génica con un gen de interés utilizando un vector viral recombinante como lanzadera es la habilidad para dirigir específicamente el gen de interés al tejido objetivo. Los adenovirus que se utilizan para este propósito son capaces de infectar una gran variedad de células con diferentes afinidades. En realidad, el uso de un promotor específico para el tejido induce hasta un 95% de la expresión del gen de interés en el hígado; por lo tanto es muy necesaria la regulación de la expresión. Además, actualmente es factible diferenciar entre endotelio vascular normal y endotelio vascular en desarrollo en un tumor en crecimiento cuando se destina un gen.

Tanto en el desarrollo del cáncer como de enfermedades vasculares, la angiogénesis, la creación de nuevos vasos, juega un papel principal. Por lo tanto, la regulación de este proceso por medio de terapia génica del endotelio vascular puede ser tremendamente importante en la inducción de terapia dirigida para estas enfermedades.

Se obtuvo una alta eficiencia de la preproendotelina-1 (PPE-1) humana, emitida por un vector retroviral, en células endoteliales (EC) in vitro, y en modelos de animales transgénicos. Sin embargo, el estado del arte no enseña el uso de este promotor para terapia génica in vivo. La PPE-1 humana carece de los elementos reguladores encontrados en los genes para la PPE-1 de otros animales, más notablemente el ratón.

La patente estadounidense No. 5.747.340 enseña el uso del promotor de PPE-1 de múrido y de porciones del mismo. Sin embargo, esta patente no contiene indicios o sugerencias de que se pueda emplear un reforzador endotelial específico para incrementar el nivel de expresión logrado con el promotor PPE mientras se preserva la especificidad endotelial. Además, esta patente no enseña que el promotor de PPE-1 sea inducido hasta niveles más altos de transcripción bajo condiciones hipóxicas.

Sun Guo y colaboradores describen un análisis funcional del promotor del gen para la preproendotelina-1 en células epiteliales pulmonares y en monocitos. Biochemical y Biophysical Research Communications, vol. 221, no. 3, 1996, páginas 647-652.

Minchenko Alexander y colaboradores se refieren a la regulación de la expresión del gen para la endotelina-1 en células endoteliales microvasculares humanas por hipoxia y cobalto: Role of hipoxia responsive element, Molecular y Cellular Biochemistry, vol. 208, no. 1-2, Mayo 2000 (2000-05), páginas 53-62.

Bu y colaboradores se refieren a la identificación de una región reguladora específica de células endoteliales en el gen para endotelina-1 de múrido, Journal of Biological Chemistry, 19.12.1987, vol. 51, no. 51, páginas 32613-32622.

Jäger y colaboradores describen el reconocimiento transcripcional específico de células endoteliales de un vector híbrido retroviral de repetición terminal larga que contiene secuencias del promotor de prepro-endotelina-1humana, Journal of Virology, Diciembre 1999, vol. 73, no. 12, páginas 9702-9709.

Existe por lo tanto una necesidad ampliamente reconocida por, y sería muy conveniente tener, un promotor mejorado específico de células endoteliales, métodos de uso para el mismo y células transformadas con el mismo que carezcan de las limitaciones anteriores. Se espera que la invención descrita demuestre una utilidad adicional en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, cáncer y cicatrización de heridas con relación a las configuraciones previamente conocidas.

El polinucleótido aislado está definido en la reivindicación 1, la construcción de ácido nucleico está definida en las reivindicaciones 8 y 31, una célula de mamífero está definida en las reivindicaciones 10 y 33, el uso de un promotor funcional en células endoteliales está definido en la reivindicación 11, el uso de una construcción de ácido nucleico está definido en las reivindicaciones 20, 34 y 38 y el polinucleótido aislado está definido en la reivindicación 26.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que funciona como un promotor en células eucariotas. El polinucleótido aislado incluye un elemento reforzador que cuenta al menos con dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para expresar una secuencia de ácido nucleico de interés, que codifica una molécula activa de ARN o una proteína tal como una enzima, una molécula reportera y similares en células endoteliales. El método incluye la administración a un individuo de una construcción que incluye la secuencia de ácido nucleico de interés posicionada bajo el control regulatorio de un promotor funcional en células eucariotas. La construcción incluye además un elemento reforzador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo aún con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para regular la angiogénesis en un tejido. El método comprende la administración de una construcción de ácido nucleico que incluye: (a) un promotor específico de una célula endotelial; (b) al menos una copia de un elemento de respuesta a una hipoxia expuesto en la SEQ ID NO. 5; y (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis, estando la secuencia de ácido nucleico bajo control regulador del promotor y el elemento de respuesta a la hipoxia.

De acuerdo aún con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que funciona como promotor en células eucariotas. El polinucleótido aislado comprende un elemento reforzador que incluye la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para regular la angiogénesis en un tejido. El método comprende la administración de una construcción de ácido nucleico que incluye: (a) un promotor específico de una célula endotelial; (b) un elemento reforzador que incluye la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7; (c) al menos una copia de un elemento de respuesta a una hipoxia expuesto en la SEQ ID NO. 5; y (d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis, estando la secuencia de ácido nucleico bajo control regulador del promotor, el elemento reforzador y el elemento de respuesta a la hipoxia.

De acuerdo aún con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que funciona como promotor en células eucariotas, el polinucleótido aislado comprende un elemento reforzador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8.

De acuerdo aún con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para expresar una secuencia de ácido nucleico de interés en células endoteliales, el método incluye la administración a un individuo una construcción, la construcción incluye la secuencia de ácido nucleico de interés posicionada bajo el control regulador de un promotor que...

1. Un polinucleótido aislado que funciona como un elemento regulador, el polinucleótido aislado comprendiendo al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8, siendo dicho elemento regulador capaz de regular la expresión de una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor funcional en células endoteliales.

2. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho elemento regulador incluye además al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

3. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho elemento regulador incluye una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8 y al menos dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

4. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho promotor que funciona en células endoteliales comprende al menos una copia del promotor de PPE-1.

5. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, que comprende además un elemento de respuesta a la hipoxia.

6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 5, en donde dicho elemento de respuesta a la hipoxia incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.

7. El polinucleótido aislado de la reivindicación 1, en donde dicho elemento regulador es como el expuesto en la SEQ ID NO: 7.

8. Una construcción de ácido nucleico que comprende al polinucleótido aislado de la reivindicación 1 y una secuencia de ácido nucleico de interés, dicha secuencia de ácido nucleico de interés estando bajo el control regulador de dicho polinucleótido aislado.

9. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 8, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de interés es seleccionada del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

10. Una célula de mamífero transformada con el polinucleótido aislado de la reivindicación 1.

11. El uso de una construcción funcional en células endoteliales para la fabricación de un medicamento para la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en células endoteliales, dicha construcción comprendiendo una secuencia de ácido nucleico de interés posicionada bajo el control regulador de un promotor funcional en células endoteliales, y un elemento regulador que incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8.

12. El uso de 11, en donde dicho promotor exhibe especificidad de célula endotelial.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde dicho promotor es el promotor de PPE-1 como el expuesto en la SEQ ID NO: 1.

14. El uso de la reivindicación 11, en donde dicho elemento regulador incluye además al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

15. El uso de la reivindicación 14, en donde dicho elemento regulador es como el expuesto en la SEQ ID NO: 7.

16. El uso de la reivindicación 14, en donde dicha al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6 incluye dos copias.

17. El uso de la reivindicación 14, en donde dichas al menos dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6 son contiguas.

18. El uso de la reivindicación 11, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de interés es seleccionada del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

19. El uso de la reivindicación 11, en donde dicho medicamento está diseñado para administración por medio de un método seleccionado del grupo que consiste de:

20. El uso de una construcción de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para regular la angiogénesis en un tejido, comprendiendo la construcción de ácido nucleico:

21. El uso de la reivindicación 20, en donde dicho medicamento está diseñado para administración por medio de un método seleccionado del grupo que consiste de:

22. El uso de la reivindicación 20, en donde dicha construcción de ácido nucleico incluye además:

23. El uso de la reivindicación 22, en donde dicha al menos una copia de una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6 incluye dos copias contiguas.

24. El uso de la reivindicación 20, en donde dicho promotor específico de células endoteliales comprende al menos una copia del promotor de PPE-1.

25. El uso de la reivindicación 20, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis se selecciona del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

26. Un polinucleótido aislado funcional como promotor en células eucariotas, el polinucleótido aislado comprendiendo un elemento regulador que incluye la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7.

27. El polinucleótido aislado de la reivindicación 26, que comprende además un elemento promotor endotelial específico.

28. El polinucleótido aislado de la reivindicación 27, en donde dicho elemento promotor endotelial específico comprende al menos una copia del promotor de PPE-1.

29. El polinucleótido aislado de la reivindicación 26, que comprende además un elemento de respuesta a la hipoxia.

30. El polinucleótido aislado de la reivindicación 29, en donde dicho elemento de respuesta a la hipoxia incluye al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5.

31. Una construcción de ácido nucleico que comprende al polinucleótido aislado de la reivindicación 28 y una secuencia de ácido nucleico de interés, estando dicha secuencia de ácido nucleico de interés bajo el control regulador de dicho polinucleótido aislado.

32. La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 31, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de interés se selecciona del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

33. Una célula de mamífero transformada con el polinucleótido aislado de la reivindicación 28.

34. El uso de una construcción de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para regular la angiogénesis en un tejido, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico:

35. El uso de la reivindicación 34, en donde dicho medicamento está diseñado para administración por medio de un método seleccionado del grupo que consiste de:

36. El uso de la reivindicación 34, en donde dicho promotor específico de células endoteliales comprende al menos una copia del promotor de PPE-1 (SEQ ID NO: 1).

37. El uso de la reivindicación 34, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica un regulador de angiogénesis se selecciona del grupo que consiste de VEGF, p55 y PDGF-BB.

38. El uso de una construcción de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para regular la angiogénesis en un tejido, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico:

39. El uso de la reivindicación 38, en donde dicho elemento regulador incluye además al menos una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

40. El uso de la reivindicación 38, en donde dicho elemento regulador incluye una copia de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8 y al menos dos copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

41. El uso de la reivindicación 38, en donde la construcción de ácido nucleico incluye además un elemento de respuesta a la hipoxia.