Promotores del virus del mosaico de las nervaduras de la mandioca y sus usos.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos del promotor que,

en unacélula de planta, puede iniciar la transcripción de una secuencia de ácido nucleico que no es del CsVMV unidaoperativamente, en la que dicha secuencia de nucleótidos del promotor se selecciona entre la SEC ID Nº: 14, SECID Nº: 5 y SEC ID Nº: 16, no conteniendo la molécula de ácido nucleico aislada otras partes del genoma delCsVMV.

Promotores del virus del mosaico de las nervaduras de la mandioca y sus usos

Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones y a procedimientos útiles en la producción de plantas transgénicas. En particular, la invención se refiere a las secuencias de los promotores de virus de plantas (CsVMV) y a casetes de expresión que contienen las secuencias de los promotores del CsVMV (virus del mosaico de las nervaduras de la mandioca, Cassava Vein Mosaic Virus) . La invención también se refiere a vectores y a plantas transgénicas que contienen las secuencias de los promotores del CsVMV que están unidas operativamente a secuencias de ADN heterólogo. Adicionalmente, la invención se refiere a procedimientos de producción de plantas transgénicas usando vectores que contengan las secuencias de los promotores del CsVMV.

Antecedentes de la invención Los promotores de virus de plantas aislados son útiles en la modificación de plantas por ingeniería genética para producir plantas transgénicas con características fenotípicas deseadas. Para producir dichas plantas transgénicas, un promotor aislado se inserta en un vector y se une operativamente a una secuencia de ADN heterólogo. Después, las células de las plantas pueden transformarse de diversas maneras mediante construcciones de ADN que contengan un promotor aislado fusionado a las secuencias de ADN heterólogo. El resultado de esta transformación es, que el promotor, unido operativamente al ADN heterólogo, se inserta en el genoma de la célula de la planta transformada. Además, el promotor controla la regulación de la expresión del ADN heterólogo en la célula de la planta transformada.

Dependiendo de la naturaleza de las secuencias heterólogas acopladas al promotor aislado, existen diversas estrategias diferentes para producir un fenotipo deseado en una planta transgénica. Por ejemplo, la expresión de un nuevo gen, que normalmente no se expresa en una planta o en un tejido particular de una planta, puede conferir un cambio fenotípico. Como alternativa, la expresión de una construcción, en sentido o en antisentido, introducida en plantas transgénicas, puede producir la inhibición de la expresión de los genes de las plantas endógenos. Esta inhibición de expresión puede, a su vez, producir el cambio fenotípico deseado.

Existe una necesidad de usar diversos promotores diferentes en la modificación de plantas por ingeniería genética. Estos promotores son de diversos tipos. Los promotores constitutivos constituyen uno de estos tipos de promotores normalmente usados. Los promotores constitutivos pueden expresar secuencias de ADN unidas operativamente en todos los tejidos de una planta a través del desarrollo normal. A diferencia de los promotores constitutivos, los promotores específicos de tejido, son promotores que pueden expresar de manera selectiva secuencias de ADN heterólogo en determinados tejidos de plantas. Los promotores también pueden ser inducibles, por ejemplo, aplicando agentes inductores externos. Los promotores constitutivos, inducibles y específicos de tejido se usan en la modificación de las plantas por ingeniería genética, y son valiosos en ese campo para muchas posibles aplicaciones diferentes.

Los promotores constitutivos de plantas pueden obtenerse aislando la región reguladora de un operón de una planta que se expresa de manera constitutiva. Además de los promotores obtenidos a partir de genes de plantas, también existen promotores de origen bacteriano y viral, que se han usado para expresar, de manera constitutiva, nuevas secuencias en tejidos de plantas. Son ejemplos de dichos promotores de bacterias los que incluyen el promotor de octopina sintasa (ocs) , el promotor de nopalina sintasa (nos) y otros derivados de plásmidos Ti naturales (véase Herrera-Estrella y col, Nature, 303: 209-213, 1983) . Los promotores 35S y 19S del virus del mosaico de la coliflor son ejemplos de promotores virales normalmente usados (véase Odel y col, Nature, 313: 810-812, 1985) .

A diferencia de los promotores constitutivos, los promotores específicos de tejido están generalmente aislados de las regiones promotoras de los genes de plantas que se expresan de manera selectiva en un tejido específico de planta. Estos promotores pueden fusionarse con una secuencia de ADN heterólogo y usarse para transformar una célula de planta para crear plantas transgénicas que expresen de manera selectiva el ADN heterólogo en un tejido específico. Por ejemplo, las regiones promotoras de los genes E4 y E8 regulados por etileno, específicos de frutos, y del gen de poligalacturonasa, específico de frutos, se han usado para dirigir la expresión específica de frutos de una secuencia de ADN heterólogo en plantas de tomate transgénicas. (Véase Cordes y col, Plant Cell, 1; 1025-1034, 1989; Deikman y col, EMBO J., 7; 3315-3320, 1988; y Della Penna y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 6420-6424, 1986) .

Se han descrito aspectos de caracterización, incluyendo clonación genómica, caracterización molecular y secuenciación, y la descripción de los promotores, de diversos virus de plantas diferentes, incluyendo el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) , Hull, en “Virus Taxonomy”, eds. Murphy y col., Wein, Nueva York, Springer-Verlag, páginas 189-192, 1995; el virus del moteado amarillo de la Commelina (ComYMV) , Medberr y y col, Nuc.Acid Res.,

18: 5505-5513, 1990; el virus baciliforme del tungro del arroz (RTBV) , Hay y col, Nuc. Acids Res., 19: 2615-2621, 1991; el virus baciliforme de la caña de azúcar (ScBV) , Bouhida y col, J. Gen. Virol, , 74: 15-22, 1993; el virus del moteado clorótico de la soja (SbCMV) Hasegawa y col, Nuc. Acids Res., 17: 9993-10013, 1989; el virus del mosaico de la higuera (FMV) , Richins y col, Nuc. Acids Res., 15: 8451-8466, 1987; el virus de la mancha en anillo del grabado del clavel (CERV) , Hull y col, EMBO J., 5: 3083-3090, 1986; el virus del veteado clorótico del cacahuete

(PCSV) , Reddy y col, Phytopathol., 83: 129-133, 1993; el virus de banda de la nervadura de la fresa (SVBV) , Nº de Acceso a GeneBank X97304; y el virus de la hinchazón de los brotes del cacao (CSSV) , Nº Acceso GeneBank L14546.

Calvert y col, J. Gen. Virol., 76: 1271-1276, 1995, describieron el virus del mosaico de la nervadura de la mandioca (anteriormente denominado CVMV, actualmente denominado CsVMV) y también se publicaron datos de secuencias como Nos de Acceso a GeneBank U59751 y U20341. Además, Verdaguer y col, Plant Mol. Biol., 31: 1129-1139, 1996, describieron recientemente el promotor del CsVMV.

Se desea el descubrimiento, tanto de nuevos promotores constitutivos como de nuevos promotores específicos de tejido, para la expresión controlada de diversas secuencias de ácido nucleico que se modifican, por ingeniería genética, en plantas transgénicas. Existen muchas posibles aplicaciones valiosas de modificación de plantas por ingeniería genética. Para poner en práctica estas posibles aplicaciones, es deseable que exista una diversidad de promotores de plantas con diferentes características y que sean eficaces en diferentes especies de plantas.

Sumario breve Actualmente, como promotor para la expresión de genes heterólogos, se ha clonado y caracterizado molecularmente un promotor derivado del CsVMV que puede usarse en una diversidad de tipos de células de plantas transgénicas. El promotor del CsVMV, y los promotores derivados descritos en el presente documento, proporcionan diversas ventajas y beneficios.

Se demuestra que los promotores son activos en especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, y por lo tanto, pueden aplicarse fácilmente a una diversidad de cultivos cultivados. Aunque en el presente documento, se describen promotores generalmente constitutivos, los promotores derivados incluyen promotores que pueden regular la expresión de una manera específica de tejido, y son, por lo tanto, útiles para controlar la expresión de genes heterólogos de una manera específica de tejido.

Por tanto, en una realización la divulgación contempla una molécula de ácido nucleico aislada que, en una célula de planta, comprende una secuencia de nucleótidos del promotor que puede iniciar la transcripción de una secuencia de ácido nucleico heterólogo unida operativamente, en la que la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de al menos el 80% con 18 nucleótidos secuenciales del virus del mosaico de las nervaduras de la mandioca (CsVMV) mostrado en la SEC ID Nº: 3 (pA) .

Una molécula de ácido nucleico preferida comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en CVP1, CVP2, pA, pB, pC, pD, pE, p!B, p!C, p!D1, p!D2, p!D3, p!DE1, p!DE2, p!DE3 y p!E.

También se contempla un vector que comprende... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos del promotor que, en una célula de planta, puede iniciar la transcripción de una secuencia de ácido nucleico que no es del CsVMV unida operativamente, en la que dicha secuencia de nucleótidos del promotor se selecciona entre la SEC ID Nº: 14, SEC

ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 16, no conteniendo la molécula de ácido nucleico aislada otras partes del genoma del CsVMV.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha célula de planta es una monocotiledónea o dicotiledónea.

3. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos del promotor que, en una célula de planta, puede iniciar

la transcripción de una secuencia de ácido nucleico que no es del CsVMV unida operativamente, en la que dicha secuencia de nucleótidos del promotor se selecciona entre la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 16, estando unida operativamente dicha secuencia de nucleótidos del promotor a una secuencia de ácido nucleico que no es del CsVMV.

4. Una planta transgénica que comprende una secuencia de nucleótidos del promotor que, en una planta, puede iniciar la transcripción de una secuencia de ácido nucleico que no es del CsVMV unida operativamente, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 16, estando unida operativamente dicha secuencia de nucleótidos del promotor a una secuencia de ácido nucleico que no es del CsVMV.

5. Un procedimiento de expresión, en una célula de planta, de una secuencia de ácido nucleico que no es del 20 CsVMV que comprende:

a) la transformación de dicha célula de planta con un vector de acuerdo con la reivindicación 3; y b) el cultivo de dicha célula de planta en condiciones en las que la secuencia de ácido que no es del CsVMV se exprese en dicha célula de planta.

6. Un gen quimérico que, en células de plantas, expresa una secuencia de ácido nucleico que no es del CsVMV que 25 comprende, unidas operativamente en secuencia, en dirección 5’ a 3’:

a) una secuencia de nucleótidos del promotor que, en una célula de planta, puede iniciar la transcripción de una secuencia de ácido nucleico que no es del CsVMV unida operativamente, en la que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre la SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 15 y SEC ID Nº: 16, y b) una secuencia de ácido nucleico estructural que es secuencia.