Procedimiento para producir ácido glicólico por regeneración de coenzima.

Un procedimiento para producir ácido glicólico a partir de etilenglicol usando Escherichia coli que tieneuna actividad de NADH deshidrogenasa potenciada,

en el que la Escherichia coli se puede obtener introduciendo enEscherichia coli un gen que codifica la NADH deshidrogenasa.

Procedimiento para producir ácido glicólico por regeneración de coenzima.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un microorganismo Escherichia coli que produce ácido glicólico y a un procedimiento para producir ácido glicólico usando el microorganismo E. coli.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

Puesto que los ácidos hidroxicarboxílicos son útiles como materias primas para polímeros y un compuesto intermedio para medicamentos, se ha pedido un procedimiento para producir ácidos hidroxicarboxílicos de forma eficaz.

Como ejemplo, se puede mencionar el ácido glicólico (ácido α-hidroxiacético) . El ácido glicólico se ha usado como una materia prima para agentes de limpieza o cosméticos, pero recientemente ha recibido atención como materia prima para el poli (ácido glicólico) que es útil como un polímero barrera frente a gases o un polímero para medicina. La razón por la que el ácido glicólico ha recibido atención como un material barrera frente a gases es que una capa de poli (ácido glicólico) tiene una alta propiedad y rendimiento de barrera frente al oxígeno como material para el envasado de alimentos o bebidas carbonatadas que se pueden estropear fácilmente en presencia de oxígeno.

El ácido glicólico de un producto sintetizado químicamente que está actualmente disponible en el comercio, contiene bastantes impurezas, lo cual es un problema cuando se usa como una materia prima para polímeros en vista de la pureza. Esto se debe a que estas impurezas inhiben una reacción de condensación deshidratante del ácido glicólico, y también el metoxi-acetato, que es una de estas impurezas, es un compuesto sospechoso de ser potencial carcinógeno, siendo por lo tanto deseable no incluirlo en un material de envasado para alimentos o bebidas. Técnicamente se pueden eliminar las impurezas por purificación, pero dichos productos purificados tienen un alto coste y por lo tanto no son prácticos como una materia prima para el envasado de bajo coste.

Con el fin de evitar los problemas mencionados antes dados en el ácido glicólico de los productos sintetizados químicamente, se ha intentado una producción de ácido glicólico de acuerdo con un bioprocedimiento que usa etilenglicol como una materia prima. En el documento de patente 1 y documento de patente 2, se ha descrito un procedimiento para producir ácido glicólico por un microorganismo, que incluye cultivar levadura que pertenece al género Pichia, género Rhodotorula, género Sporobolomyces, genus Kluyveromyces o género Torulopsis, una cepa que pertenece al género Nocardia, una cepa que pertenece al género Rhodococcus, o una cepa de Escherichia coli B, en un medio de cultivo que contiene etilenglicol y separar y recoger el ácido glicólico del caldo de cultivo. Entre los procedimientos para producir ácido glicólico descritos en los ejemplos del documento de patente 1 y documento de patente 2, un procedimiento que usa Pichia naganishii da la mayor concentración de acumulación de ácido glicólico y se obtienen 35, 3 g/l de ácido glicólico mediante una reacción durante 30 h. Con respecto a la producción de ácido glicólico con el uso de Pichia naganishii, se ha publicado en el documento de no patente 1 que se pueden obtener 105 g/l de ácido glicólico mediante una reacción de 120 h con condiciones de reacción además mejoradas.

En el documento de patente 3, se ha descrito que se pueden producir ácidos hidroxicarboxílicos incluyendo ácido glicólico a partir de una materia prima tal como alcoholes polihídricos alifáticos que tienen un grupo hidroxilo al final, tal como etilenglicol, usando un microorganismo en el que se introduce un gen que codifica la lactaldehído reductasa y un gen que codifica la lactaldehído deshidrogenasa, en forma de plásmido, para así impartir

o potenciar una actividad de esas enzimas, y también se describe que se mejora la capacidad de producir ácido 50 glicólico mediante alteración de un gen que codifica la glicolato oxidasa contenido en un microorganismo, para así inactivar una actividad de la enzima.

En una reacción para producir ácidos hidroxicarboxílicos incluyendo el ácido glicólico, por los procedimientos convencionales mencionados antes, la cantidad de células microbianas necesarias para la reacción es grande, lo 55 cual causa problemas tales como un aumento en el coste de producción, contaminación por impurezas derivadas de las células microbianas, y se requiere mucho más trabajo y coste para desechar las células microbianas después de la producción de los ácidos hidroxicarboxílicos.

En un procedimiento para producir cetona a partir de alcohol usando una oxidasa, se ha usado una técnica como se describe a continuación, en la que el dinucleótido de nicotinamida y adenina de tipo oxidado (en lo sucesivo, se puede denominar NAD) necesario para una reacción se regenera a partir del dinucleótido de nicotinamida y adenina de tipo reducido (en lo sucesivo, se puede denominar NADH) producido junto con la reacción. Es decir, hay un procedimiento que combina dos reacciones, se combinan una reacción de oxidación para producir una cetona propuesta y una reacción de reducción de cetona para regenerar el NAD, una técnica combinada con una reacción de reducción del ácido oxoglutárico por la ácido glutámico deshidrogenasa, y similares.

En la técnica anterior para regenerar el NAD, se pueden mencionar los problemas de que es necesario añadir un sustrato de reacción para regenerar el NAD en el sistema de reacción y que se acumulan subproductos de la reacción para regenerar el NAD en el sistema de reacción.

En la producción de cetona a partir de alcohol se ha descrito un procedimiento para compensar los problemas anteriores, en los que se usa la NADH deshidrogenasa para regenerar NAD por una reducción de oxígeno en forma molecular por la cadena de respiración de un microorganismo para producir agua (documento de patente 4) , pero no se han descrito ejemplos existentes de microorganismos que tienen una actividad potenciada de las enzimas.

[Documento de patente 1] Patente japonesa abierta a consulta por el público Nº H10-174593 [Documento de patente 2] Patente japonesa abierta a consulta por el público Nº H10-174594 [Documento de patente 3] Publicación internacional Nº WO 2005/106005 [Documento de patente 4] Patente japonesa abierta a consulta por el público Nº 2005-218349

[Documento de no patente 1] Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 65 (10) , pp. 2265-2270, (2001)

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un procedimiento de síntesis química no es suficientemente bueno desde el punto de vista de la 30 pureza de los ácidos hidroxicarboxílicos que se van a obtener, y el bioprocedimiento convencional tiene el problema de la eliminación de cepas al usar una gran cantidad de células microbianas en la reacción de producción.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento industrialmente ventajoso para producir ácido glicólico, por el cual se pueda producir de forma eficaz el ácido glicólico usando una pequeña cantidad de células 35 microbianas, usando un microorganismo E. coli.

A partir de los resultados de estudios para resolver los objetos anteriores, los autores de la presente invención han encontrado que se puede producir de forma eficaz ácido glicólico a partir de etilenglicol usando un microorganismo E. coli en el que se potencie la capacidad para regenerar dinucleótido de nicotinamida y adenina de tipo oxidado.

Es decir, la presente invención es como se describe en [1] a [4] a continuación en el presente documento.

[1] Un procedimiento para producir ácido glicólico a partir de etilenglicol usando NADH deshidrogenasa de E. coli que se puede obtener introduciendo un gen codificante.

[2] El procedimiento de producción como se expone en [1], en el que la E. coli tiene una actividad potenciada de al

menos una enzima de lactaldehído reductasa y lactaldehído deshidrogenasa, y la E. coli se puede obtener introduciendo en E. coli un gen que codifica al menos una enzima de fucO y aldA de la lactaldehído reductasa y lactaldehído deshidrogenasa.

[3] El procedimiento de producción expuesto en [1], en el que la E. coli tiene una actividad de glicolato oxidasa 55 inactivada o menor que la actividad de E. coli existente, que se puede obtener por alteración del gen glcDEF que codifica la glicolato oxidasa.

[4] Una E. coli que tiene una actividad potenciada de al menos una enzima de lactaldehído reductasa y lactaldehído deshidrogenasa, y la E. coli se puede obtener introduciendo en E. coli un gen que codifica al menos una enzima de fucO y aldA de la lactaldehído reductasa y lactaldehído... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir ácido glicólico a partir de etilenglicol usando Escherichia coli que tiene una actividad de NADH deshidrogenasa potenciada, en el que la Escherichia coli se puede obtener introduciendo en 5 Escherichia coli un gen que codifica la NADH deshidrogenasa.

2. El procedimiento de producción expuesto en la reivindicación 1, en el que la Escherichia coli tiene una actividad potenciada de al menos una enzima de lactaldehído reductasa y lactaldehído deshidrogenasa, en el que la Escherichia coli que tiene actividad potenciada se puede obtener introduciendo en Escherichia coli un gen que codifica al menos una enzima de fucO y aldA de la lactaldehído reductasa y lactaldehído deshidrogenasa.

3. El procedimiento de producción expuesto en la reivindicación 1, en el que la Escherichia coli tiene una actividad de la glicolato oxidasa inactivada o menor que la actividad de Escherichia coli existente, en el que la Escherichia coli que tiene actividad inactivada o menor se puede obtener por alteración del gen glcDEF que codifica la glicolato oxidasa.

4. Una Escherichia coli que tiene (i) al menos una actividad enzimática potenciada de la lactaldehído reductasa y la lactaldehído deshidrogenasa, en la que la Escherichia coli que tiene la actividad potenciada se puede obtener introduciendo en Escherichia coli un gen que codifica al menos una enzima de fucO y aldA de la lactaldehído reductasa y lactaldehído deshidrogenasa; (ii) una actividad potenciada de la NADH deshidrogenasa; y

(iii) una actividad de la glicolato oxidasa inactivada o reducida, en la que la Escherichia coli que tiene la actividad inactivada o reducida se puede obtener por alteración del gen glcDEF que codifica la glicolato oxidasa, en la que la Escherichia coli se puede obtener introduciendo en Escherichia coli un gen que codifica la NADH deshidrogenasa.