Procedimiento de producción de alfa-santaleno.

Un procedimiento de producción de α-santaleno que comprende

a) poner en contacto FPP (farnesil pirofosfato) con al menos un polipéptido que tiene una actividad α

-santalenosintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1;

b) opcionalmente, aislar el α-santaleno producido en la etapa a).

Procedimiento de producción de alfa-santaleno

Campo técnico

La presente invención proporciona un procedimiento de producción de !-santaleno, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto al menos un polipéptido con farnesil pirofosfato (FPP) . En particular, dicho procedimiento puede llevarse a cabo in vitro o in vivo para producir !-santaleno, un compuesto muy útil en los campos de la perfumería y los aromatizantes. La presente invención también proporciona la secuencia de aminoácidos de un polipéptido útil en el procedimiento de la invención. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención y un vector de expresión que contiene dicho ácido nucleico también son parte de la presente invención. Un organismo huésped no humano o una célula transformada para usarse en el procedimiento de producir !-santaleno también son un objeto de la presente invención.

Técnica anterior

Los terpenos se encuentran en la mayoría de los organismos (microorganismos, animales y vegetales) . Estos compuestos se componen de cinco unidades de carbono llamadas unidades de isopreno y se clasifican por el número de estas unidades presentes en su estructura. Por lo tanto los monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos son terpenos que contienen 10, 15 y 20 átomos de carbono respectivamente. Los sesquiterpenos, por ejemplo, se encuentran ampliamente en el reino vegetal. Muchas moléculas de sesquiterpeno se conocen por sus propiedades saporíferas y de fragancia y sus efectos cosméticos, medicinales y antimicrobianos. Se han identificado más de 300 hidrocarburos de sesquiterpenos y 3000 sesquiterpenoides y se identifican muchas estructuras nuevas cada año. Se usan como fuente de terpenos extractos vegetales obtenidos por diferentes medios tales como destilación por vapor o extracción de disolvente. Las moléculas de terpeno se usan con frecuencia tal cual, pero en algunos casos se usan reacciones químicas para transformar los terpenos en otras moléculas de alto valor.

La producción biosintética de terpenos implica enzimas llamadas terpeno sintasas. Hay prácticamente una infinitud de sesquiterpenos sintasas presentes en el reino vegetal, que usan todas el mismo sustrato (farnesil pirofosfato, FPP) pero que tienen diferentes perfiles de producto. Se han clonado genes y ADNc que codifican sesquiterpeno sintasas y se han caracterizado las enzimas recombinantes correspondientes. La biosíntesis de terpenos en plantas y otros organismos se ha estudiado exhaustivamente y no se detalla adicionalmente en el presente documento, pero se hace referencia a Dewick, Nat. Prod. Rep., 2002, 19, 181-222, que revisa el estado de la técnica de las rutas biosintéticas del terpeno.

!-santaleno es una molécula de sesquiterpeno de origen natural. El isómero (+) puede usarse como material de partida para la síntesis química o la biosíntesis de (Z) - (+) -!-santalol, que es un constituyente importante del aceite de sándalo. El aceite de sándalo es un ingrediente de perfumería importante obtenido por destilación del duramen de especies de Santalum. El sándalo también se usa en gran medida para inciensos y medicina tradicional. El aceite contiene 90% de alcoholes de sesquiterpeno. (Z) - (+) -!-santalol y (Z) - (-) -∀-santalol representan los constituyentes principales (respectivamente 45-47% y 20-30%) y son principalmente responsables del olor balsámico y de madera dulce típico del aceite de sándalo. Otros constituyentes tales como epi-∀-santalol y trans-!-bergamotol también están presentes y pueden contribuir a la importancia del sándalo.

En general, el precio y disponibilidad de extractos naturales vegetales depende de la abundancia, producción de aceite y origen geográfico de las plantas. Además, la disponibilidad y calidad de los extractos naturales depende en gran medida del clima y otras condiciones locales que conducen a variabilidad de un año a otro, haciendo el uso de dichos ingredientes en perfumería de alta calidad muy difícil o incluso imposible algunos años. Debido a la sobreexplotación de los recursos naturales, dificultades de cultivo, crecimiento lento de las plantas de Santalum, la disponibilidad de materia prima de sándalo se ha reducido drásticamente durante las últimas décadas. Por lo tanto, sería una ventaja proporcionar una fuente de (Z) - (+) -!-santalol, que esté menos sujeta a fluctuaciones de disponibilidad y calidad. No está disponible hasta la fecha una síntesis química de los constituyentes de sesquiterpeno de sándalo. Sería por lo tanto de gran interés una ruta bioquímica que condujera a la síntesis de (+) -!-santaleno, que podría después usarse para producir (Z) - (+) -!-santalol. Dada la dificultad para controlar la producción de sesquiterpeno en especies de Santalum, se han buscado fuentes vegetales alternativas.

El sesquiterpeno de tipo santalano, y particularmente sesquiterpenos con el esqueleto de !-santalano, se ha identificado en varias especies vegetales. Se ha indicado que Clausena lansium, una planta de la familia Rutaceae contiene grandes cantidades de sesquiterpenos de santalano en las hojas. Zhao y colaboradores (Zhao y col, Z. Naturforsch, 2004, 59c, 153-156) han analizado las hojas de C. lansium de China y han detectado la presencia de !santalol y ∀-santalol. El análisis de las hojas de C. lansium de Cuba ha revelado la presencia de (Z) -!-santalol, epi-∀santalol, (Z) -∀-santalol y (E) -∀-santalol (Pino y col., J. Essent. Oil Res., 2006, 18, 139-141) . Sorprendentemente el análisis de diferentes partes de C. lansium de origen tailandés no mostró la presencia de sesquiterpenos con esqueletos de santalano (Chokeprasert y col, Journal of Food Composition and Analysis, 2007, 20 (1) , 52-56) .

Una sesquiterpeno sintasa capaz de sintetizar al menos un sesquiterpeno bicíclico y/o tricíclico que tiene un esqueleto de carbono de santalano, el ácido nucleico correspondiente y un procedimiento de producción de dichos compuestos que tienen un esqueleto de carbono de santalano, se desvelan en la solicitud de patente Internacional WO 2006/134523. Se citan (+) -epi-∀-santaleno, (-) -∀-santaleno, (+) -∀-santaleno, (+) -!-santaleno y (-) -!-santaleno como ejemplos de compuestos que tienen un esqueleto de carbono de santalano. No obstante, la sesquiterpeno sintasa proporcionada en los ejemplos no produce !-santaleno. Solamente se produce epi-∀-santaleno. Las propiedades de este compuesto son muy diferentes de las del !-santaleno. En particular, epi-∀-santaleno no es de interés en la síntesis de (Z) - (+) -!-santalol. Además, la sesquiterpeno sintasa desvelada en el documento WO 2006/134523 comparte solamente el 37% de identidad con la secuencia de la invención.

También se han encontrado terpenos sintasas que tienen un cierto porcentaje de identidad de secuencia con la secuencia de la !-santaleno sintasa de la presente invención en las bases de datos de secuencias. No obstante, el porcentaje de identidad entre las sesquiterpeno sintasas conocidas y el polipéptido de la invención es muy bajo. La secuencia proteica más cercana a la (+) -!-santaleno sintasa de la invención es una (E) -∀-farneseno sintasa de Citrus junos (Nº de referencia del NCBI AAK54279; Maruyama y col, Biol. Pharm. Bull., 2001, 24 (10) , 1171-1175) que comparte del 67 al 68% de identidad de secuencia de aminoácidos con la !-santaleno sintasa de la invención.

Además de la diferencia entre las secuencias en sí mismas, también debe indicarse que la estructura y las propiedades de los productos sintetizados por la enzima anteriormente mencionada son muy diferentes de las de !santaleno. En particular (E) -∀-farneseno no es adecuado como un material de partida para la síntesis de (Z) - (+) -!santalol, que es un ingrediente muy útil en el campo de la perfumería.

Se desvela una !-santaleno sintasa en el documento WO 2008/142318. Este documento no se ha publicado a la fecha de la presente solicitud de prioridad. Describe una enzima capaz de catalizar la transformación de Z, Z-farnesil pirofosfato a !-santaleno. Por lo tanto la reacción catalizada por la enzima de la técnica anterior es diferente de la catalizada por la sintasa de la presente invención, que comienza a partir de E, E-farnesil pirofosfato. Además, la !santaleno sintasa de la invención comparte solamente el 23, 8% de identidad de secuencia con la descrita en el documento WO 2008/142318.

A pesar de estudios exhaustivos de la ciclación de terpenos, el aislamiento y caracterización de las terpeno sintasas es aún difícil, particularmente en plantas, debido a su baja abundancia, sus patrones de expresión con frecuencia transitorios, y la complejidad de purificarlas a partir de las mezclas de resinas y compuestos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de !-santaleno que comprende

a) poner en contacto FPP (farnesil pirofosfato) con al menos un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1; b) opcionalmente, aislar el !-santaleno producido en la etapa a) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa a) comprende cultivar un organismo o célula huésped no humano capaz de producir FPP y transformado para expresar al menos un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1 y que tiene una actividad !-santaleno sintasa, en condiciones que conducen a la producción de !-santaleno.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el procedimiento comprende además, antes de la etapa a) , transformar un organismo o célula huésped no humano capaz de producir FPP con al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1 y que tiene una actividad !-santaleno sintasa, de modo que dicho organismo exprese dicho polipéptido.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el al menos un ácido nucleico que codifica la !-santaleno sintasa comprende una secuencia de nucleótidos al menos 50%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 90% idéntica a SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico consiste en SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

7. El procedimiento de la reivindicación 3 o 4, en el que el al menos un ácido nucleico usado en cualquiera de las realizaciones anteriores comprende una secuencia de nucleótidos que ha sido obtenida modificando SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el organismo huésped no humano es una planta, un procariota o un hongo.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el organismo huésped no humano es un microorganismo, preferentemente una bacteria o una levadura.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la célula huésped no humana es una célula vegetal o una fúngica.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de producción de !-santaleno como un producto principal.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el !-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos obtenidos.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de producción de (+) -!-santaleno y en el que el polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa tiene una actividad (+) -!-santaleno sintasa.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que se obtiene (+) -!-santaleno como un producto principal.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que (+) -!-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos obtenidos.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el al menos un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70%, preferentemente al menos 90% idéntica a SEC ID Nº: 1.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que el al menos un polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el al menos un polipéptido consiste en SEC ID Nº: 1.

20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 7 a 17, en el que el al menos un polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido obtenida modificando SEC ID Nº: 1.

21. Un polipéptido que tiene una actividad !-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 50% idéntica a SEC ID Nº: 1.

22. El polipéptido de la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido es capaz de producir !-santaleno como un producto principal.

23. El polipéptido de la reivindicación 22, en el que dicho polipéptido es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que !-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos producidos.

24. El polipéptido de la reivindicación 21, en el que dicho polipéptido tiene una actividad (+) -!-santaleno sintasa.

25. El polipéptido de la reivindicación 24, en el que dicho polipéptido es capaz de producir (+) -!-santaleno como un producto principal.

26. El polipéptido de la reivindicación 25, en el que dicho polipéptido es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que (+) -!-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos producidos.

27. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70%, preferentemente al menos 90% idéntica a SEC ID Nº: 1.

28. El polipéptido de la reivindicación 27, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1.

29. El polipéptido de la reivindicación 28, en el que dicho polipéptido consiste en SEC ID Nº: 1.

30. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido obtenida modificando SEC ID Nº: 1.

31. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30.

32. El ácido nucleico de la reivindicación 31, que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 50%, preferentemente al menos 70%, preferentemente al menos 90% idéntica a SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

33. El ácido nucleico de la reivindicación 32, que comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

34. El ácido nucleico de la reivindicación 33, que consiste en SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

35. El ácido nucleico de la reivindicación 31 o 32, que comprende una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando SEC ID Nº: 2 o el complemento de la misma.

36. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35.

37. El vector de expresión de la reivindicación 36, en forma de un vector viral, un bacteriófago o un plásmido.

38. El vector de expresión de la reivindicación 36 o 37, que incluye el ácido nucleico de la invención unido operativamente al menos a una secuencia reguladora que controla la transcripción, inicio o terminación de la traducción, tal como un promotor transcripcional, operador o potenciador o un sitio de unión ribosómico de ARNm y, opcionalmente, que incluye al menos un marcador de selección.

39. Un organismo o célula huésped no humano transformado para albergar al menos un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35, de modo que exprese de forma heteróloga o sobreexprese al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30.

40. El organismo huésped no humano de la reivindicación 39, en el que dicho organismo huésped no humano es una planta, un procariota o un hongo.

41. El organismo huésped no humano de la reivindicación 39, en el que dicho organismo huésped no humano es un microorganismo, preferentemente una bacteria o levadura.

42. El organismo huésped no humano de la reivindicación 41, en el que dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

43. La célula eucariota superior de la reivindicación 39, en la que dicha célula eucariota superior es una célula vegetal o una célula fúngica.

44. Un procedimiento de producción de al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones

a 30 que comprende a) cultivar un organismo o célula huésped no humano transformado con el vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, de modo que albergue un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 y exprese o sobreexprese un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30; b) aislar el polipéptido del organismo o célula huésped no humano cultivado en la etapa a) .

45. El procedimiento de la reivindicación 44, que comprende además, antes de la etapa a) , transformar un organismo o célula huésped no humano con el vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, de modo que albergue un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35 y exprese o sobreexprese el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30.

46. Un procedimiento de preparaación de un polipéptido variante que tiene actividad !-santaleno sintasa que comprende las etapas de:

(a) seleccionar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 35;

(b) modificar el ácido nucleico seleccionado para obtener al menos un ácido nucleico mutante;

(c) transformar células u organismos unicelulares huésped con la secuencia de ácido nucleico mutante para expresar un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico mutante;

(d) explorar el polipéptido con respecto a al menos una propiedad modificada; y

(e) opcionalmente, si el polipéptido no tiene actividad !-santaleno sintasa variante deseada, repetir las etapas de procedimiento (a) a (d) hasta que se obtenga un polipéptido con una actividad !-santaleno sintasa variante deseada;

(f) opcionalmente, si se identificó un polipéptido que tenía una actividad !-santaleno sintasa variante deseada en la etapa (d) , aislar el ácido nucleico mutante correspondiente obtenido en la etapa (c) .

47. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 46, en el que el polipéptido variante preparado es capaz de producir !-santaleno como un producto principal.

48. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 47, en el que el polipéptido variante preparado es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que !-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos producidos.

49. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 46, en el que el polipéptido variante preparado tiene una actividad (+) -!-santaleno sintasa.

50. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 49, en el que el polipéptido variante preparado es capaz de producir (+) -!-santaleno como un producto principal.

51. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 50, en el que el polipéptido variante preparado es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que (+) -!-santaleno representa al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, preferentemente al menos el 90% de los sesquiterpenos producidos.