Proceso para hidrólísis enzimática de materias primas lignocelulósicas pretratadas.

Un proceso para hidrólisis enzimática de una materia prima lignocelulósica pretratada hasta azúcares solubles,

comprendiendo el proceso la adición de una mezcla de enzimas celulasa a la materia prima lignocelulósicapretratada, comprendiendo dicha mezcla de enzimas celulasa una mezcla de celulasas primarias decelobiohidrolasas CBH1 y CBH2 y endoglucanasas EG1 y EG2, estando presentes dichas celobiohidrolasas CBH1 yCBH2 a más de o igual a 55% y menos de 85% de la mezcla de celulasas primarias en peso, estando presentedicha CBH2 a una fracción en peso con respecto a la celobiohidrolasa CBH1 y CBH2 tal como lo define fC2 y estandopresente dicha EG2 a una fracción en peso con respecto a las endoglucanasas EG1 y EG2 tal como lo define fE2, endonde

cuando dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes por encima de o igual a 55% y menos de 65% delas celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a oiguales a 0.15 y menores de 0.35;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 superiores a o iguales a0.15 y menores de 0.25; o

dichos valores fc2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a oiguales a 0.35 y menores de 0.45,

cuando dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes por encima de o iguales a 65% y menores de 75%de las celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.25 y menores de 0.35 y dichos valores fE2 son superiores a oiguales a 0.05 y menores de 0.35;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a oiguales a 0.05 y menores de 0.55;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a oiguales a 0.05 y menores de 0.65; o

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.65 y menores de 0.75 y dichos valores fE2 son superiores a oiguales a 0.15 y menores de 0.55,

cuando dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes por encima de o iguales a 75% y menores de 85%de las celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a oiguales a 0.05 y menores de 0.25;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a oiguales a 0.15 y menores de 0.65; o

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.55 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a oiguales a 0.15 y menores de 0.35

y en donde las celulasas primarias son de una fuente fúngica.

Proceso para hidrólísis enzimática de materias primas lignocelulósicas pretratadas Campo de la invención La presente invención se relaciona con una mezcla de enzimas. También se provee un proceso para la hidrólisis enzimática de una materia prima lignocelulósica, en particular para la hidrólisis enzimática de una materia prima lignocelulósica pretratada.

Antecedentes de la invención El etanol combustible es producido normalmente a partir de materias primas tales como almidón de maíz, caña de azúcar y remolachas de azúcar. Sin embargo, el potencial para producción de etanol a partir de estas fuentes es limitado puesto que la mayor parte de los terrenos que son adecuados para la producción de estos cultivos ya están en uso para proveer una fuente alimenticia para humanos y animales. Adicionalmente, la producción de etanol a partir de estas materias primas tiene significativas emisiones de gases de invernadero porque se utilizan combustibles fósiles en el proceso de conversión.

La producción de etanol, a partir de materias primas que contienen celulosa, tales como residuos agrícolas, pastos y residuos forestales, ha recibido mucha atención en años recientes. Las razones para estos son porque estas materias primas están ampliamente disponibles y no son costosas y su uso para la producción de etanol provee una alternativa a la quema u ocupación de tierras con materiales residuales lignocelulósicos. Además, una porción de la materia prima, la lignina puede ser utilizada como combustible para alimentar el proceso, en vez de combustibles fósiles. Varios estudios han concluido que, cuando se tiene en cuenta el ciclo completo de producción y consumo, el uso de etanol producido a partir de celulosa genera cero gases de invernadero.

Las materias primas celulósicas que son las más prometedoras para la producción de etanol incluyen (1) residuos agrícolas tales como leña, espigas de trigo, espigas de cebada, espigas de avena, espigas de arroz, espigas de canola, y espigas de soja; (2) pastos tales como pasto de aguja, miscanthus, pasto de cordón, y pasto rojo canario;

(3) residuos de procesos de fibra tales como fibra de maíz, pulpa de remolacha, finos y rechazos de molinos de pulpa y bagazo de caña de azúcar; (4) residuos forestales tales como madera de álamo, otras maderas duras, maderas blandas y aserrín; y (5) productos residuales de papel postconsumo.

La etapa de proceso más importante para la conversión de una materia prima lignocelulósica en etanol involucra conversión de celulosa en glucosa, para conversión subsecuente a etanol por fermentación. Los dos procesos primarios para lograr estos son hidrólisis ácida, la cual involucra la hidrólisis de la materia prima utilizando una etapa simple de tratamiento con ácido, e hidrólisis enzimática, la cual involucra un pretratamiento con ácido seguido por hidrólisis con enzimas de celulasa.

En el proceso de hidrólisis ácida, la materia prima se somete típicamente a vapor y ácido sulfúrico a una temperatura, concentración de ácido y longitud de tiempo que son suficientes para hidrolizar la celulosa a glucosa y la hemicelulosa a xilosa y a arabinosa. El ácido puede ser concentrado (25-80% p/p) o diluido (3-8% p/p) . La glucosa se fermenta entonces a etanol utilizando levadura, y el etanol se recupera y purifica por destilación. Opcionalmente, la glucosa puede ser fermentada a ácido láctico, butanol u otros productos.

En el proceso de hidrólisis enzimática, las condiciones de reacción se escogen de tal manera que el área superficial de celulosa se incremente notablemente a medida que la materia prima fibrosa es convertida en una textura lodosa, pero hay poca conversión de la celulosa a glucosa. La celulosa pretratada es hidrolizada entonces a glucosa en una etapa subsecuente que utiliza enzimas de celulasa, y el tratamiento con vapor y/o ácido en este caso se conoce como pretratamiento. La glucosa puede ser fermentada entonces a etanol, ácido láctico, butanol u otros productos. Antes de la adición de la enzima, el pH de la materia prima ácida es ajustado a un valor que sea adecuado para la reacción de hidrólisis enzimática. Típicamente, esto involucra la adición de un álcali a un pH de entre aproximadamente 4 a aproximadamente 6, el cual es el rango de pH óptimo para muchas celulasas, aunque el pH puede ser más alto si se usa celulasas alcalofílicas.

En un tipo de proceso de pretratamiento, la presión producida por el vapor disminuye rápidamente con descompresión explosiva, lo que se conoce como explosión de vapor. Foody (Patente de los Estados Unidos No. 4, 461, 648) describe el equipo y condiciones usadas en el pretratamiento de explosión de vapor. La explosión de vapor con ácido sulfúrico llevada a cabo a un pH de 0.4 a 2.0 produce material pretratado que es uniforme y requiere menos enzima celulasa para hidrolizar la celulosa que otros procesos de pretratamiento.

Las enzimas de celulasa catalizan la hidrólisis de la celulosa (hidrólisis de enlaces fi- 1, 4-D-glucano) en la materia prima a producto tales como glucosa, celobiosa y otros celooligosacáridos. La celulasa es un término genérico que denota una mezcla multienzimática que comprende celobiohidrolasas exoactivas (CBH) , endoglucanasas (EG) y ºglucosidasas (ºG) que pueden ser producidas por un cierto número de plantas y microorganismos. Las enzimas en la celulasa de la Trichoderma reesei las cuales contienen un dominio de enlazamiento de la celulosa incluyen CBH1 (más generalmente, CeI7A) , CBH2 (CeI6A) , EG1 (CeI7B) , EG2 (CeI5) , EG4 (CeI61A) , EG5 (CeI45A) , EG6 (CeI74A) , Cip1, Cip2, acetil xilan esterasa, º-mananasa, y swolenina. La EG3 (CeI12A) es un ejemplo de una enzima celulolítica sin un dominio de enlazamiento de celulosa.

Las enzimas de celulasa trabajan de manera sinérgica para hidrolizar celulosa a glucosa. La CBH1 y la CBH2 actúan en extremos opuestos de las cadenas de celulosa para liberar celobiosa (Barr et al., 1996) , mientras que las endoglucanasas actúan en localizaciones internas en la celulosa. El producto primario de esas enzimas es celobiosa, la cual es hidrolizada posteriormente a glucosa mediante º-glucosidasa. Se sabe que la mayoría de los CBH y EG se enlazan a la celulosa en la materia prima a través de módulos de enlazamiento de carbohidrato (CBM) , tales como dominios de enlazamiento de celulosa (CB) , mientras que la mayor parte de las enzimas ºglucosidasa, incluyendo las enzimas de º-glucosidasa de Trichoderma y Aspergillus, no contienen tales módulos de enlazamiento y por lo tanto permanecen en solución durante la hidrólisis. Las enzimas de celulasa pueden contener una región de enlazamiento que conecta el dominio catalítico al módulo de enlazamiento de carbohidratos. Se cree que en la región de enlazamiento facilita la actividad del dominio activo catalíticamente.

La cinética de la hidrólisis enzimática de sustrato celulósicos insolubles por celulasas no sigue el comportamiento simple de Michaelis-Mentea (Zhang et al., 1999) . Específicamente, al incrementar la dosis de celulasa en una reacción de hidrólisis no se provee un incremento linealmente dependiente en la cantidad de glucosa producida en un tiempo dado. También hay un descenso significativo en la rata de reacción a medida que avanza la hidrólisis de la celulosa (Tolan, 2002) . Se han propuesto varias explicaciones para explicar el descenso en la rata de reacción. La hipótesis principal incluye inhibición por producto, incremento de la resistencia del sustrato a través del trascurso de una hidrólisis e inactivación enzimática.

La cinética de la acción de la celulasa hace que la hidrólisis enzimática del material de pretratamiento una etapa ineficiente en la producción de etanol de celulosa. La reducción de costos asociada con la hidrólisis enzimática, a través del incremento de la producción o actividad de la celulasa, se ha identificado como una oportunidad principal para ahorro de costes (Sheehan, 1999) . Un reporte reciente de un taller de etanol celulósico patrocinado por el United States Department of Energy estimó un coste de 10 a 25 veces más alto para producir las enzimas para etanol de celulosa que para las enzimas requeridas para producir etanol a partir de almidón (Houghton, 2006) .

Se han hecho muchas aproximaciones para incrementar la actividad de las mezclas de celulasa. El incremento de la cantidad de º-glucosidasa producida por el microorganismo el cual también secreta las celulasas mixtas alivia la inhibición por producto por celubiosa (Patente de los Estados Unidos No. 6, 015, 703) . Las técnicas de diseño racional o mutagénesis aleatoria también pueden ser utilizadas para modular las propiedades de enzimas individuales tal como lo demuestra la... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para hidrólisis enzimática de una materia prima lignocelulósica pretratada hasta azúcares solubles, comprendiendo el proceso la adición de una mezcla de enzimas celulasa a la materia prima lignocelulósica pretratada, comprendiendo dicha mezcla de enzimas celulasa una mezcla de celulasas primarias de celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 y endoglucanasas EG1 y EG2, estando presentes dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 a más de o igual a 55% y menos de 85% de la mezcla de celulasas primarias en peso, estando presente dicha CBH2 a una fracción en peso con respecto a la celobiohidrolasa CBH1 y CBH2 tal como lo define fC2 y estando presente dicha EG2 a una fracción en peso con respecto a las endoglucanasas EG1 y EG2 tal como lo define fE2, en donde cuando dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes por encima de o igual a 55% y menos de 65% de las celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.35;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.25; o dichos valores fc2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45,

cuando dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes por encima de o iguales a 65% y menores de 75% de las celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.25 y menores de 0.35 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.35;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.55;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.65; o dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.65 y menores de 0.75 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.55,

cuando dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes por encima de o iguales a 75% y menores de 85% de las celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.25;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.65; o dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.55 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.35

y en donde las celulasas primarias son de una fuente fúngica.

2. El proceso de la reivindicación 1 en donde dicha celobiohidrolasa CBH1 y CBH2 están presentes a 75% hasta 85% de las celulasas primarias en peso y

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.25;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.55; o

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.55 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.25.

3. El proceso de la reivindicación 1, en donde dicha celobiohidrolasa CBH1 y CBH2 están presentes a 65% hasta 75% de las celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.25 y menores de 0.35 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.35;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.55; o dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.55.

4. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las celulasas primarias son de Trichoderma reesei.

5. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las celulasas primarias son obtenidas a partir de un microorganismo que expresa secuencias de codificación que son endógenas o heterólogas para dicho microorganismo.

6. El proceso de la reivindicación 5, en donde las celulasa primarias son obtenidas a partir de Trichoderma reesei.

7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la hidrólisis enzimática convierte al menos aproximadamente 80% de la celulosa en la materia prima lignocelulósica pretratada en azúcares solubles.

8. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la hidrólisis enzimática se lleva a cabo con enzimas de celulasa que comprenden -glucosidasa y un secretoma de Trichoderma reesei.

9. Una mezcla de enzimas de celulasa que comprende una mezcla de celulasas primarias de celobiohidrolasa CBH1 y CBH2 y endoglucanasas EG1 y EG2, estando presentes dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 a más de o igual a 55% y menos de 85% de la mezcla de celulasa primaria en peso, estando presente dicha CBH2 en una fracción en peso relativa a la celobiohidrolasa CBH1 y CBH2 tal como lo define fC2 y estando presente dicha EG2 en una fracción en peso relativa a las endoglucanasas EG1 y EG2 tal como lo define fE2, en donde

cuando dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes por encima de o iguales a 55% y menores de 65% de las celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.35;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.25; o dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45,

when said CBH1 and CBH2 celobiohidrolasas están presentes por encima de o iguales a 65% y menores de 75%de las celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.25 y menores de 0.35 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.35;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.55;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.65; o dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.65 y menores de 0.75 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.55,

cuando dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes por encima de o iguales a 75% y menores de 85% de las celulasas primarias en peso,

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.25;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.65; o dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.55 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.35

y en donde la celulasas primarias son de una fuente fúngica.

10. La mezclas de enzimas de celulasa de la reivindicación 9, en donde dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes a 75% hasta 85% de las celulasas primarias en peso y

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.25;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.55; o dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.55 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.25.

11. La mezcla de enzimas de celulasa de la reivindicación 10, en donde dichos valores fC2 son superiores o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.25.

12. La mezcla de enzimas de celulasa de la reivindicación 9, en donde dichas celobiohidrolasas CBH1 y CBH2 están presentes a 65% hasta 75% de las celulasas primarias en peso y

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.25 y menores de 0.35 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.35;

dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.05 y menores de 0.55; o dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.55.

13. La mezcla de enzimas de celulasa de la reivindicación 12, en donde dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.45 y menores de 0.55 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.15 y menores de 0.55; o dichos valores fC2 son superiores a o iguales a 0.55 y menores de 0.65 y dichos valores fE2 son superiores a o iguales a 0.35 y menores de 0.45.

14. La mezcla de enzimas de celulasa de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde la mezcla de enzimas de celulasa es producida expresando las celulasas primarias a partir de un microorganismo a valores de pH entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5.