Procedimientos para la preparación, el aislamiento y la purificación de epotilona B y estructuras cristalinas de rayos X de epotilona B.

Una cepa de Sorangium cellulosum depositada como ATCC Nº PTA-3880.

Procedimientos para la preparación, el aislamiento y la purificación de epotilona B y estructuras cristalinas de rayos X de epotilona B

Campo de la invención En la presente memoria se describen procedimientos mejorados para la producción, el aislamiento y la purificación de la epotilona B. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, un procedimiento de fermentación para la producción de epotilona B, el aislamiento a través de la adsorción en una resina y la posterior purificación.

Antecedentes de la invención Las epotilonas son una clase relativamente nueva de compuestos macrólidos que se obtuvieron originalmente por fermentación de mixobacterias (Sorangium cellulosum) . Estos compuestos se investigaron inicialmente como agentes protectores de las plantas, debido a sus propiedades antifúngicas. Las epotilonas adquirieron posteriormente interés debido a su actividad citotóxica en células animales y se caracterizaron posteriormente como agentes de polimerización de la tubulina. Ahora se sabe que las epotilonas ejercen efectos estabilizadores de microtúbulos similares a paclitaxel (TAXOL®) y la actividad citotóxica contra células que proliferan rápidamente, tales como células tumorales u otra enfermedad celular hiperproliferativa. El uso de epotilonas como agentes quimioterapéuticos se describe en Bollag et al., Cancer Research 55, 2325, 1995.

Las epotilonas A y B (epo A o epo B, respectivamente) tienen las estructuras

Epotilona A R=H Epotilona B R=Me Un esquema para la obtención de epotilonas fue revelado por Höfle y col. en el documento WO 93/10121. Höfle cultivó una cepa de Sorangium cellulosum en un medio que contenía fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y sales minerales. Durante el cultivo de la cepa se añadió una resina adsorbente. Las epotilonas se eluyeron con el disolvente de la resina adsorbente. Las diferentes epotilonas se separaron por cromatografía de fase inversa y cristalizaron. Sin embargo, Höfle y col. reconocieron que este procedimiento producía sólo una cantidad mínima de epotilona B y también que la relación entre epotilona B y epotilona A en la fermentación fue baja. Esta baja proporción de epotilona B en relación con epotilona A hace que la recuperación de la epotilona B pura sea difícil. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de procedimientos mejorados de fermentación para producir epotilona B en preferencia a epotilona A y procedimientos mejorados de aislamiento y purificación de la epotilona B

Sumario de la invención La presente invención se refiere a nuevas cepas de Sorangium cellulosum obtenidas por mutagénesis para la producción de epotilonas.

También se divulgan procedimientos para mejorar la relación entre la epotilona B y A producida por la nueva cepa de Sorangium cellulosum proporcionando un aditivo para la fermentación. En una realización preferida, el aditivo es propionato, ácido propiónico con ajuste apropiado del pH, u otro precursor de propionato.

También se divulga en la presente invención un procedimiento de extracción mejorado para el aislamiento de la epotilona B del medio de fermentación usando una resina. También se divulgan procedimientos para el lavado de resina rica en epotilona para reducir los niveles de impureza y mejorar el procesamiento en sentido descendente.

También se divulga en la presente invención un procedimiento mejorado para la purificación de epotilona B. En una realización, la purificación se consigue usando cristalización. En otra realización, la purificación se consigue por procedimientos cromatográficos que incluyen cromatografía de fase normal o cromatografía de fase inversa. En otra realización más, la purificación se consigue mediante una combinación de cristalización y purificación de las muestras por cromatografía, incluyendo la cromatografía normal y en fase inversa. En una realización adicional, el extracto de resina se procesa por cristalización solamente.

Le epotilona B ("epo B") es útil como un intermedio en la preparación del derivado 1 ("D1") , (como se describe en la patente US-6.262, 094) , donde el 2 metilo en el anillo tiazol se sustituye con una amina:

Derivado 1

La epotilona B también es útil en la preparación del derivado 2 ("D2") (tal conversión de la lactona de la epotilona B a la lactama de derivado 2 se describe por Borzilleri y col., J. Amer. Chem. Soc. 122, 8890, 2000, y en el documento WO 99/02514) :

Derivado 2

Además, la epotilona B ("epo B") es útil para la preparación del derivado 3 (epotilona D, "D3") (como se describe en la patente US-6.320.045) :

Derivado 3

Además, se divulgan en la invención las formas cristalinas de epotilona B producidas usando los procedimientos y 15 materiales descritos en la presente memoria.

Se ha de entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ejemplares.

Breve descripción de los dibujos Las ventajas, la naturaleza y diversas características de la invención pueden aparecer más completas con la consideración de los dibujos adjuntos. En los dibujos:

La figura 1 muestra la estructura molecular en la celda unidad monoclínica de la forma epoB-EAβ, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de acetato de etilo en el canal adicional de la celda unidad monoclínica. La Figura 2 muestra la estructura molecular en la celda unidad monoclínica de la forma epoB-ANB, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de acetonitrilo en el canal de la célula huésped de la celda unidad

monoclínica. La Figura 3 muestra la estructura molecular en la celda unidad monoclínica de la forma epoB-Ipβ, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de isopropanol en el canal de la célula huésped de la celda unidad monoclínica. La Figura 4 muestra la estructura molecular en la celda unidad monoclínica de la forma epoB-Toβ, con dos moléculas de epotilona B y dos moléculas de tolueno en el canal huésped de la unidad monoclínica. La Figura 5 muestra los patrones de PXRD observados (parte superior) y simulados (parte inferior) del solvato acetato de etilo (forma cristalina epoB-EAβ) de la epotilona B. En la Figura 5, el patrón simulado se calculó a partir de los parámetros atómicos refinados de la estructura cristalina monoclínica a -33 ºC y el patrón observado se midió a 23 ºC. La figura 6 muestra los patrones de PXRD observados (parte superior) y simulados (parte inferior) del solvato tolueno (forma cristalina epoB-TOβ) de la epotilona B. En la Figura 6, el patrón simulado se calculó a partir de los parámetros atómicos en la estructura cristalina monoclínica a -33 ºC y el patrón observado se midió a 23 ºC. La figura 7 muestra los patrones de PXRD observados (parte superior) y simulados (parte inferior) del solvato acetonitrilo (forma cristalina EPOb-ANβ) de la epotilona B. En la figura 7, el patrón simulado se calculó a partir de los parámetros refinados atómicas en la estructura cristalina monoclínica a -40 ºC y el patrón observado se midió a 23 ºC. La figura 8 muestra los patrones de PXRD observados (parte superior) y simulados (parte inferior) del solvato alcohol isopropílico (forma cristalina epoB-IPβ) de la epotilona B. En la figura 8, el patrón simulado se calculó a partir de los parámetros atómicos refinados en la estructura cristalina monoclínica a -3 ºC, y el patrón observado se midió a 23 ºC. La Figura 9 muestra un patrón de PXRD observado para un solvato de grado primario que contiene tolueno de la grado de la epotilona B producido según el procedimiento descrito en el Ejemplo 7, Etapa A. La Figura 10 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) para el solvato de grado primario que contiene tolueno de la Figura 9. La Figura 11 muestra un patrón de PXRD observado para un solvato recristalizado que contiene tolueno de la epotilona B, producido según el procedimiento descrito en el Ejemplo 7, Etapa B. La Figura 12 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) para el solvato recristalizado que contiene tolueno de la Figura 11. La Figura 13 muestra un patrón de PXRD observado para el solvato que contiene acetato de etilo de la epotilona B, producido según el procedimiento descrito en el Ejemplo 7, Etapa C. La Figura 14 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) para el solvato que contiene acetato de etilo de la Figura 13.

La Figura 15 muestra un patrón de PXRD observado (parte superior) del solvato que contiene tolueno preparado según el procedimiento descrito en el Ejemplo 7C, junto con un patrón de PXRD simulado (inferior) del solvato tolueno de la epotilona B a temperatura ambiente.

La Figura 16 muestra el análisis térmico (DSC y TGA) del solvato que contiene tolueno de la... [Seguir leyendo]

1. Una cepa de Sorangium cellulosum depositada como ATCC Nº PTA-3880.

2. Una cepa de Sorangium cellulosum depositada como ATCC Nº PTA-3881.