Procedimientos de mejora de anidamiento e injerto de células madre.

Un procedimiento para mejorar el potencial de anidamiento e injerto celular,

comprendiendo el procedimientosometer ex vivo o in vitro una población de células a de 0,01 a 60 mg/ml de nicotinamida durante un periodo detiempo insuficiente para la expansión de células madre, siendo dicho periodo de tiempo de 10-30 horas en el quedicha población de células es una población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas CD34+

Procedimientos de mejora de anidamiento e injerto de células madre Campo y antecedentes de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para mejorar la eficacia de anidamiento, retención e injerto de células trasplantadas.

El trasplante de médula ósea (TMO) es un procedimiento clínico en el que células hematopoyéticas pluripotentes obtenidas de la médula ósea se trasplantan en un paciente. El TMO es el tratamiento de elección en diversos trastornos hematológicos, incluyendo tumores malignos, Inmunodeficiencia Combinada Grave (SCID, por las siglas de su denominación en inglés Severe Combined Immune Deficiencies) , anomalías hematopoyéticas congénita o genéticamente determinadas, anemia, anemia aplásica, leucemia y osteoporosis.

Las células madre hematopoyéticas primitivas o pluripotentes normalmente residen en la médula ósea, aunque la sangre del cordón umbilical es otra fuente funcional de células madre/progenitoras hematopoyéticas trasplantables (Gluckman, E., y col 1989 N. Engl. J. Med. 321: 1174) . Todas estas células hematopoyéticas primitivas pueden identificarse por su antígeno CD34 de superficie. Las células madre hematopoyéticas se diferencian a lo largo de una de dos rutas principales – bien en células madre linfoides o en células madre mieloides. Ambas se diferencian posteriormente en células progenitoras para cada tipo de célula sanguínea madura. Estas células progenitoras han perdido la capacidad de auto regenerarse y están comprometidas con una línea celular determinada. Por tanto, las células madre linfoides se diferencian en linfocitos T o B progenitores y las células madre mieloides se diferencian en células progenitoras de eritrocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, mastocitos y plaquetas.

En condiciones de estado de equilibrio estacionario, la mayoría de las células progenitoras y células madre hematopoyéticas residen en la médula ósea y solo algunas de estas células pueden detectarse en la sangre periférica. Sin embargo, las células madre pueden movilizarse en la sangre periférica por tratamiento con agentes mielosupresores y/o determinados factores de crecimiento hematopoyéticos. Estudios realizados han demostrado que las células madre de sangre periférica (CMSP) infundidas en un hospedador presentan un potencial mejorado para el injerto en comparación con las células progenitoras y células madre derivadas de la médula ósea. Por tanto, las CMSP movilizadas por quimioterapia, factores de crecimiento hematopoyéticos o una combinación de estas modalidades se usan actualmente en entornos de trasplante tanto autólogo como no autólogo [Anderlini, P. y Korbling, M. (1997) Stem. Cells 15, 9-17]. En el caso de un trasplante no autólogo, los donantes de las células madre son individuos sanos y el procedimiento para movilizar las células madre en la corriente sanguínea debe conseguirse con una mínima molestia. En este caso, se prefiere la movilización de las células madre con factores de crecimiento hematopoyéticos a la movilización con fármacos antiblásticos (es decir ciclofosfamida) .

Además de células madre y progenitoras, para el trasplante pueden usarse células más diferenciadas, para el tratamiento de enfermedades o afecciones de órganos específicos o de tejidos caracterizados por disfunción celular

o muerte celular. En muchas de estas enfermedades, los procedimientos quirúrgicos o las terapias médicas actuales son inadecuados o no existen. La terapia celular puede sustituir o aumentar el tejido existente para proporcionar terapia restaurativa para estas afecciones. Como tipos de células ejemplares adecuados para trasplantes se incluyen: células derivadas de tejido neuronal, hepatocitos, miocitos, células retinales, células endocrinas, melanocitos, queratinocitos, y condrocitos. Se ha observado, tanto en modelos con animales como en estudios con seres humanos, que el injerto de células trasplantadas puede reestablecer satisfactoriamente la función tisular. Por tanto, pueden trasplantarse neuronas, por ejemplo, para la enfermedad de Parkinson y otras enfermedades neurodegenerativas. Células musculares, tales como mioblastos, pueden trasplantarse, por ejemplo, para el tratamiento de miopatía cardiaca isquémica. Las células de los islotes pueden trasplantarse para tratar la diabetes y/u otras afecciones o enfermedades relacionadas con la insulina y el glucagón. También pueden trasplantarse células sanguíneas diferenciadas, tales como linfocitos y células dendríticas, por ejemplo, para inmunoterapia adoptiva con linfocitos citolíticos naturales (células NK, por las siglas de su denominación en inglés Natural Killer)

Sin embargo, estudios realizados han demostrado que la mayoría de las células trasplantadas, tales como hepatocitos y células neurales, se eliminan del organismo después del trasplante, y no se localizan en órganos o tejidos diana (De Roos y col Transplantation 1997; 63: 513-18; Gagandeep y col, Gene Therapy 1999; 6: 729-36) . Esfuerzos realizados para mejorar el anidamiento, la retención y el injerto de células trasplantadas, tales como el tratamiento de hepatocitos con Con A antes del implante (Ito y col, Muscle Nerve 1998; 21: 291-7) solo han sido ligeramente eficaces. Por tanto, se han realizado esfuerzos en procedimientos para agrupar y conservar células recién preparadas (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.713.245 y 6.821.779 de Koopmans y col) para proporcionar mayores cantidades de células para el trasplante.

Después del trasplante, las células deben migrar hacia sus tejidos diana. Los quimoatrayentes, tales como determinadas citocinas (CXCL1-CXCL16 y CCL1-CCL-27) ayudan a conducir las células hacia su objetivo. El factor 1α derivado de células estromales (SDF-1α) , denominado también CXCL12, es un poderoso quimioatrayente de células CD34 +, incluyendo células madre hematopoyéticas y células madre neuronales (Aiuti J. Exp. Med. 1997;

185: 111-120) y se expresa ampliamente en muchos tejidos durante el desarrollo (McGrath Dev. Biol. 1999; 213:

442-456) y en adultos (Imai Br. J. Haematol. 1999; 106: 905-911) . También atrae células no madre tales como linfocitos T. El receptor 4 de la quimiocina CXC (CXCR4) , es el receptor afín del SDF-1α y se expresa en células madre. Recientes estudios han implicado al SDF-lα/CXCR4 como una ruta que activa programas moleculares con células madre y la migración durante lesiones (Jaime Imitola y col., Proc Natl Acad Sci U S A. 28 de diciembre del 2004; 101 (52) : 18117-18122) .

La CD26/dipeptidilpeptidasa IV (DPPIV) una peptidasa extracelular unida a membrana que escinde dipéptidos, tales como SDF-1α, desde el extremo N de las cadenas polipeptídicas después de una prolina o una alanina, es un antígeno específico no específico de línea cuya expresión en células hematopoyéticas y en otras células se regula por diferenciación y activación. La escisión proteolítica de las quimiocinas tiene implicaciones con respecto a la capacidad de las células para ser atraídas y/o activadas por quimoquinas (Baggiolini, M.. 1998, Nature 392: 565) .

Diversos estudios funcionales aluden la función que desempeña la CD26/DPPIV en la migración y movilización de linfocitos T y células hematopoyéticas [Shioda y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6331]. Se demostró que la inhibición de la actividad endógena de CD26/DPPIV sobre células CD34+ mejoraba la respuesta quimiotáctica de estas células contra el SDF-1α (Christopherson KW 2nd, y col., Science. 13 de agosto del 2004; 305 (5686) : 10001003; Christopherson KW 2nd, J Immunol. 15 de diciembre del 2002; 169 (12) : 7000-7008) , mientras que el truncamiento en el extremo N del SDF-1α con DPPIV no inducía la migración de células del cordón umbilical CD34+.

La nicotinamida (NA) , la forma amida de la niacina (vitamina B3) , es un sustrato de intercambio de bases y un fuerte inhibidor de enzimas dependientes de NAD (+) dotadas con actividades mono- y poli-ADP-ribosiltransferasa. La ribosilación del ADP está implicada en la modificación de una diversa serie de respuestas biológicas (Corda D, Di Girolamo M. 2003; 22 (9) : 1953-1958; Rankin PW, y col., J Biol Chem. 1989; 264: 4312-4317; Banasik M. y col., J Biol Chem. 1992; 267: 1569- 1575; Ueda K, Hayaishi O, Annu Rev Biochem. 1985; 54: 73-100; Smith S. Trends Biochem Sci. 2001; 26: 174-179; Virág L, Szabó C. Pharm. Reviews. 2002; 54: 375-429) .

Las ADP ribosiltransferasas endógenas responsables de las reacciones de mono- o poli-ADP- ribosilación modifican moléculas implicadas en la señalización celular, tales como histonas núcleo (de la Cruz X, Lois S, y col., Bioessays. 2005; 27 (2) : 164-75)... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para mejorar el potencial de anidamiento e injerto celular, comprendiendo el procedimiento someter ex vivo o in vitro una población de células a de 0, 01 a 60 mg/ml de nicotinamida durante un periodo de tiempo insuficiente para la expansión de células madre, siendo dicho periodo de tiempo de 10-30 horas en el que dicha población de células es una población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas CD34+.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha población de células deriva de una fuente seleccionada del grupo que consiste en células de sangre de cordón umbilical, células de sangre periférica movilizadas, células de médula ósea.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha población de células deriva de una 10 fracción de células mononucleares.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que adicionalmente comprende la etapa de seleccionar una población de células enriquecida con células madre hematopoyéticas antes de, simultáneamente con o después de, dicha etapa de sometimiento ex vivo.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho periodo de tiempo es suficiente para 15 regular negativamente la expresión de CD26 en las células.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha cantidad de nicotinamida y dicho periodo de tiempo se seleccionan para que sean suficientes para reducir la expresión de CD26 por las células de dicha población de células en comparación con la expresión de CD26 en células madre y/o progenitoras hematopoyéticas mantenidas durante el mismo periodo de tiempo en ausencia de nicotinamida, en el que dicha expresión de CD26 se mide in vitro mediante análisis FACS.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 6, en el que dicho periodo de tiempo es de 20 horas.

8. Una población de células que comprende células madre y/o progenitoras hematopoyéticas caracterizada por un

potencial de injerto y anidamiento mejorado preparado de acuerdo con el procedimiento de una cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 5 o 7.

9. Una composición farmacéutica que comprende, como principio activo, la población de células de la reivindicación 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La población de células de la reivindicación 8, que se aísla y se prepara para un trasplante en un sujeto que lo necesita.