Procedimientos de diagnóstico para determinar el pronóstico del cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Un procedimiento para determinar el pronóstico del cáncer de pulmón en un paciente humano,

comprendiendo elprocedimiento:

(a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente humano clasificado como quetiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio temprano con un conjunto de sondas cromosómicasque comprende al menos dos sondas seleccionadas de entre el grupo que consiste en una sonda específica dellocus del cromosoma 5p15, una sonda específica del locus del cromosoma 8q24, una sonda de enumeración delcromosoma 6, y una sonda específica del locus del cromosoma 7p12 bajo condiciones suficientes para que seproduzca la hibridación de las sondas del conjunto a los cromosomas en la muestra, si existen;

(b) identificación delpatrón de hibridación para un pronóstico favorable del conjunto de sondas cromosómicas en la muestra biológicaseleccionada a partir del patrón de hibridación que consiste en:

(i) el clasificador de % de pérdida de 8q24/7p12 que utiliza un límite de ≥ 31% de células,

(ii) el clasificador Rango3 y el patrón de % de pérdida 8q24/CEP6 con límites de ≥ 45% de células o ≥ 24% decélulas respectivamente

(iii) la relación de señal total 8q24/5py la relación total 5p15/CEP6 con límites de< 0,80 o< 1,1respectivamente

(iv) el Intervalo Medio de Señal y el patrón Rango3 con límites de< 2,5 o ≥ 42% de células, respectivamentey

(c) determinar el pronóstico de cáncer de pulmón en un sujeto basándose en el patrón de hibridación identificadoen la etapa (b), en la que el clasificador Rango3 es el intervalo de células que muestran una diferencia en una basede célula por célula, de al menos tres señales de sonda de FISH en el locus cromosómico con el mayor número deseñales de FISH menos las señales de FISH en el locus cromosómico con el número más bajo de señales de FISHy en la que el Intervalo Medio de Señal se calcula determinando en cada célula del número total de células de lamuestra que se evalúa, la diferencia entre la sonda con el número más alto de señales de hibridación y la sonda conel menor número de señales de sonda, luego se recopila el número Rango de Señal individual celular y se divide porel número de células evaluadas.

Procedimientos de diagnóstico para determinar el pronóstico del cáncer de pulmón de células no pequeñas

Campo de la invención La invención se refiere a un ensayo de diagnóstico in vitro de muestras de tejidos de pacientes con cáncer de pulmón para determinar el pronóstico del paciente, y en particular se refiere a un ensayo in vitro para determinar el pronóstico en los pacientes en estadios tempranos, tales como aquellos que se diagnosticaron de cáncer de pulmón de células no pequeñas en Estadio Ib o Estadio II.

Antecedente de la invención El cáncer de pulmón supuso casi un tercio de las muertes por cáncer en los Estados Unidos en 2005, y se clasifica en general en dos tipos: el cáncer de pulmón de células no pequeñas y el cáncer de pulmón de células pequeñas. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) comprende el 80-85% de los casos de cáncer de pulmón en los Estados Unidos. Los tipos de NSCLC se denominan por las clases de células encontradas en el cáncer y el aspecto de las células bajo el microscopio. El NSCLC comprende tres tipos principales: (i) Carcinoma de células escamosas, que empieza en las células escamosas, que son células finas y planas que se parecen a las escamas de los peces. El carcinoma de células escamosas también se llama carcinoma epidermoide, (ii) Carcinoma de células grandes, que empieza en varios tipos de células pulmonares grandes; (iii) Adenocarcinoma, que empieza en las células de delimitan los alveolos del pulmón y producen sustancias como el mucus. Otros tipos menos comunes de NSCLC incluyen el carcinoma pleomórfico, el tumor carcinoide y el carcinoma sin clasificar.

El diagnóstico del NSCLC se hace por examen del tejido sospechoso por un patólogo, tal como una muestra de biopsia. Después del diagnóstico del NSCLC, la enfermedad del paciente se remite al pronóstico (la probabilidad de recuperación) que utiliza la salud general del paciente y la edad, la gravedad de los síntomas tales como tos y dificultad al respirar, el tipo particular de NSCLC, y la estadificación del cáncer. La estadificación tiene en cuenta el tamaño del tumor y si el tumor está presente solo en el pulmón o se ha diseminado a otros lugares del cuerpo. Las opciones particulares de tratamiento para un paciente con NSCLC se seleccionan entonces basándose en estas consideraciones y la estadificación del cáncer es un componente importante de la selección del tratamiento. Los pacientes con NSCLC en estadio temprano pueden curarse potencialmente por resección quirúrgica para eliminar el tumor, pero las modalidades actuales de diagnóstico no son capaces de predecir qué pacientes recurrirán después de la cirugía.

La página de internet National Comprehensive Cancer Network describe la estadificación de NSCLC de la siguiente manera: “El sistema utilizado más a menudo en la práctica clínica en Estados Unidos para describir el crecimiento y diseminación de un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es el sistema de estadificación TNM, también conocido como el sistema del Comité Conjunto Americano del Cáncer (AJCC) . En la estadificación TNM, se combinan la información sobre el tumor (T) , cualquier diseminación a los ganglios linfáticos cercanos (N) , y cualquier metástasis a órganos distantes (M) y se asigna un estadio a los agrupamientos específicos TNM. Los estadios agrupados se describen utilizando el número 0 y la numeración Romana del I al IV.

Las categorías “T” se basan en el tamaño del cáncer de pulmón, su diseminación y localización en los pulmones y

su diseminación a tejidos adyacentes. En la categoría Tis, el cáncer se encuentra solamente en la capa de células que delimitan los pasajes aéreos. No se ha diseminado a otros tejidos pulmonares. Esta categoría se conoce también como carcinoma in situ.

En la categoría “T1”, el cáncer no es mayor de 3 centímetros (ligeramente menor de 1 a 1 ¼ pulgadas) , no se ha diseminado a la pleura visceral (membrana que rodea los pulmones) , y no afecta las ramas principales de los bronquios.

En la categoría “T2”, el cáncer tiene una o más de las siguientes características: (i) es mayor de 3 cm; (ii) implica un bronquio principal de un pulmón pero no está más cerca de 2 cm (aproximadamente 3 ¼ a 4 pulgadas) del punto 55 donde la tráquea se ramifica en los bronquios principales izquierdo y derecho, o (iii) se ha diseminado a la pleura visceral. El cáncer puede bloquear parcialmente las vías aéreas, pero esto no produce que se colapse completamente el pulmón o que se desarrolle neumonía.

En la categoría “T3”, el cáncer tiene una o más de las siguientes características: (i) se ha diseminado a la pared torácica, el diafragma (el músculo respiratorio que separa el tórax del abdomen) , la pleura mediastínica (las membranas que rodean el espacio entre los 2 pulmones) , o el pericardio parietal (las membranas del saco que rodea el corazón) ; (ii) implica un bronquio principal de un pulmón, y está más cerca de 2 cm (aproximadamente 3 ¼ a 4 pulgadas) del punto donde la tráquea se ramifica en los bronquios principales izquierdo y derecho, pero no implica este área; o (iii) ha crecido en las vías aéreas lo suficiente para producir el colapso completo de un pulmón o para 65 causar neumonía de todo el pulmón.

En la categoría “T4”, el cáncer tiene una o más de las siguientes características: (i) se ha diseminado al mediastino (el espacio detrás del esternón y delante del corazón) , el corazón, la tráquea, el esófago (el tubo que conecta la garganta con el estómago) , la columna vertebral, o el punto donde la tráquea se ramifica en los bronquios principales izquierdo y derecho; (ii) están presentes en el mismo lóbulo dos o más nódulos tumorales separados; o (iii) está presente un derrame pleural maligno, que es la existencia de fluido que contiene células cancerosas en el espacio que rodea los pulmones.

La categoría “N” depende de que, si los hay, los ganglios linfáticos cercanos a los pulmones estén afectados por el cáncer. En la categoría N0, el cáncer no se ha diseminado a ningún ganglio linfático. En la categoría N1, el cáncer 10 se ha diseminado a los ganglios linfáticos en el pulmón o a los ganglios linfáticos del hilio (los que se localizan alrededor del área donde los bronquios entran en el pulmón) . En la categoría N1 los ganglios linfáticos afectados son solamente los del mismo lado que el pulmón canceroso. En la categoría N2, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos subcarínicos (lo que están localizados alrededor del punto donde la tráquea se ramifica en los bronquios izquierdo y derecho) o los ganglios linfáticos del mediastino (el espacio detrás del esternón y delante del

corazón) . En la categoría N2, los ganglios linfáticos afectados están en el mismo lado que el pulmón canceroso. En la categoría N3, el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos cercanos a la clavícula en cada lado, y/o a los ganglios linfáticos del hilio o mediastínicos en el lado opuesto del pulmón canceroso.

La categoría “M” depende de si el cáncer ha metastatizado y diseminado a cualquier tejido y órgano distantes. En la categoría M0, no hay diseminación distante del cáncer. En la categoría M1, el cáncer se ha diseminado a 1 o más sitios distantes. Los sitios que se consideran distantes incluyen otros lóbulos pulmonares, otros ganglios linfáticos que los que se utilizaron para determinar la categoría N del cáncer, y otros órganos o tejidos tales como hígado, huesos o cerebro.

Una vez que las categorías T, N y M se han asignado para un NSCLC en particular, esta información se combina (agrupamiento de estadios) para asignar un estadio general de 0, I, II, III, o IV (véase la Tabla 1) . Se combinan varias combinaciones de las categorías T y N en estadios. Los estadios identifican tipos tumorales que tienen un pronóstico similar y que se tratan de manera similar. Como se observa en la Tabla 1, un tumor con diseminación distante (es decir, un cáncer de categoría M1) se considera Estadio IV, teniendo en cuenta el tamaño del tumor o los ganglios linfáticos implicados. La siguiente Tabla de la página de internet NCCN muestra la clasificación de las categorías combinadas y estadios para el NSCLC.

TABLA 1

Estadio General Categoría T Categoría N Categoría M

Estadio 0 Tis N0 M0

Estadio IA T1 N0 M0

Estadio IB T2 N0 M0

Estadio IIA T1 N1 M0

Estadio IIB T2 T3 N1 N0 M0 M0

Estadio IIIA T1 T2 T3 T3 N2 N2 N1 N2 M0 M0 M0 M0

Estadio IIIB Cualquier T T4 N3 Cualquier N M0 M0

Estadio... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar el pronóstico del cáncer de pulmón en un paciente humano, comprendiendo el procedimiento: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente humano clasificado como que tiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en estadio temprano con un conjunto de sondas cromosómicas que comprende al menos dos sondas seleccionadas de entre el grupo que consiste en una sonda específica del locus del cromosoma 5p15, una sonda específica del locus del cromosoma 8q24, una sonda de enumeración del cromosoma 6, y una sonda específica del locus del cromosoma 7p12 bajo condiciones suficientes para que se produzca la hibridación de las sondas del conjunto a los cromosomas en la muestra, si existen; (b) identificación del patrón de hibridación para un pronóstico favorable del conjunto de sondas cromosómicas en la muestra biológica seleccionada a partir del patrón de hibridación que consiste en:

(i) el clasificador de % de pérdida de 8q24/7p12 que utiliza un límite de ! 31% de células,

(ii) el clasificador Rango3 y el patrón de % de pérdida 8q24/CEP6 con límites de ! 45% de células o ! 24% de 15 células respectivamente (iii) la relación de señal total 8q24/5p15 y la relación total 5p15/CEP6 con límites de < 0, 80 o < 1, 1 respectivamente (iv) el Intervalo Medio de Señal y el patrón Rango3 con límites de < 2, 5 o ! 42% de células, respectivamente y (c) determinar el pronóstico de cáncer de pulmón en un sujeto basándose en el patrón de hibridación identificado en la etapa (b) , en la que el clasificador Rango3 es el intervalo de células que muestran una diferencia en una base de célula por célula, de al menos tres señales de sonda de FISH en el locus cromosómico con el mayor número de señales de FISH menos las señales de FISH en el locus cromosómico con el número más bajo de señales de FISH y en la que el Intervalo Medio de Señal se calcula determinando en cada célula del número total de células de la muestra que se evalúa, la diferencia entre la sonda con el número más alto de señales de hibridación y la sonda con el menor número de señales de sonda, luego se recopila el número Rango de Señal individual celular y se divide por el número de células evaluadas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica comprende una biopsia o resección de tejido pulmonar.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que cada sonda cromosómica está directamente marcada con un marcador fluorescente que se puede detectar por separado.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es de un paciente clasificado como que tiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en Estadio 1b.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es de un paciente clasificado como que tiene un cáncer de pulmón de células no pequeñas en Estadio 2.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de puesta en contacto (a) se lleva a cabo en un instrumento automático.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el patrón de hibridación es la identificación de un número de 45 células en la muestra biológica que muestra la pérdida de señales 8q24 con respecto a las señales 7p12.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el número de células es al menos aproximadamente el 31 por ciento de las células evaluadas en la muestra biológica.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el patrón de hibridación es una combinación de (i) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestra una diferencia en una base de célula por célula, de al menos tres señales de sonda entre las señales de sonda en el locus cromosómico con el número más alto de señales de sonda menos las señales de sonda en el locus con el número más bajo de señales de sonda y (ii) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestra una pérdida en una base de célula por

célula de señales 8q24 con respecto a señales del centrómero 6.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el número de células que tiene una diferencia de al menos tres señales de sonda está por debajo de aproximadamente el 45 por ciento de las células evaluadas en la muestra biológica y el número de células que muestra una pérdida de señales de 8q24 con respecto a las señales del centrómero 6 es menor de aproximadamente el 24 por ciento de las células evaluadas en la muestra biológica.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el patrón de hibridación es una combinación de (i) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestran en una base de célula por célula una relación de las señales de locus 8q24 y 5p15 de ! 0, 80 y (ii) identificación de un número de células en la muestra biológica que

muestra en una base de célula por célula una relación de las señales de sonda 5p15 con respecto a las señales de sonda centrómero 6 de al menos 1, 1.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el patrón de hibridación es una combinación de (i) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestra una diferencia en una base de célula por célula, de al menos tres señales de sonda entre las señales de sonda en el locus cromosómico con el mayor número de señales de sonda menos las señales de sonda en el locus cromosómico con el menor número de señales de sonda y (ii) identificación de un número de células en la muestra biológica que muestra una diferencia de señal de sonda media en una base de célula por célula de una diferencia en las señales de sonda en el locus cromosómico con el mayor número de señales de sonda menos las señales de sonda en el locus cromosómico con el número más bajo de señales de sonda.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la diferencia de señal de sonda media es igual o mayor de aproximadamente 2, 5.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el número de células que tiene una diferencia de al menos tres

señales de sonda es menor de aproximadamente el 42% de las células evaluadas en la muestra biológica y el número de células que muestra unas diferencias medias de señal de sonda en al menos aproximadamente el 2, 5 por ciento de células evaluadas en la muestra biológica.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica comprende una muestra de citología. 20

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las sondas cromosómicas están cada una marcadas de manera fluorescente.