Procedimientos de cribado usando c-abl, fyn y sky en combinación con la proteína tau.

Un procedimiento de cribado de sustancias que son capaces de inhibir la fosforilación de una proteínatau por una tirosina quinasa en el que la proteína tau comprende uno o más sitios de fosforilación,

comprendiendo elprocedimiento:

a) poner en contacto al menos una sustancia candidata, la proteína tau y la tirosina quinasa en condiciones enlas que la tirosina quinasa es capaz de fosforilar el sitio (o sitios) de la proteína tau en ausencia de la sustanciacandidata;

b) determinar si la sustancia candidata inhibe la fosforilación y, opcionalmente en qué grado, de la proteína tauen uno o más sitios de la proteína tau por la tirosina quinasa; y

c) seleccionar la sustancia candidata que inhibe la fosforilación de la proteína tau en uno o más de los sitios;en el que la tirosina quinasa es c-Abl.

Procedimientos de cribado usando c-abl, fyn y sky en combinación con la proteína tau

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a procedimientos de cribado, y más en particular, a procedimientos relacionados con el papel de las tirosina quinasas como dianas terapéuticas para la enfermedad de Alzheimer y afecciones relacionadas.

Antecedentes de la invención [0002] La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares en el cerebro. El grado de demencia en el momento del 15 fallecimiento está más correlacionado con el número de ovillos neurofibrilares y con la pérdida neuronal y sináptica que con la cantidad de placas seniles. La presencia de ovillos neurofibrilares en las neuronas causa la muerte de dichas neuronas, lo que implica que la prevención de la formación de ovillos es un objetivo terapéutico importante. La proteína principal que forma el ovillo neurofibrilar es la proteína asociada a microtúbulos tau, que se ensambla en filamentos que se entrelazan por pares uno con otro y a los que se denomina filamentos helicoidales apareados (PHF, por sus siglas en inglés) . Los PHF se presentan en diferentes localizaciones en las neuronas en degeneración en el cerebro de pacientes con Alzheimer, y cuando muchos se agregan en el cuerpo de la célula neuronal, producen el ovillo neurofibrilar (Lee y col., 2001) .

Las placas seniles tienen un depósito central extracelular de péptido º-amiloide (Aº) , que está

rodeado por neuritas distróficas para formar la placa senil o neurítica. Se ha demostrado in vitro e in vivo que Aº es neurotóxico. El Aº deriva del procesamiento proteolítico de la proteína precursora del amiloide (APP, por sus siglas en inglés) más grande. Se ha prestado mucha atención a la producción de Aº como diana terapéutica porque se cree que su producción constituye un acontecimiento inicial en la patogénesis de la EA. Esto es debido a que las mutaciones en el gen de APP, que origina la EA autosómica dominante, da lugar al aumento de la producción total

de Aº o a un aumento relativo de la forma ligeramente más larga Aº42 sobre Aº40, siendo la primera más amiloidogénica; Aº42 tiene dos aminoácidos hidrófobos adicionales en el extremo C-terminal con respecto al Aº40 de 40 restos, dotando así al péptido de una mayor tendencia a agregarse y formar fibras de amiloide. Las mutaciones en otros dos genes que también causan EA autosómica dominante, presenilina-1 y presenilina-2 (PS1 y PS2) también originan un aumento de la relación entre Aº42 y Aº40. La creencia de que el depósito de Aº en el cerebro precede a la aparición de los ovillos neurofibrilares ha sido la base de la hipótesis de la cascada del amiloide, pero no está claro si los ovillos son importantes en la patogénesis o son simplemente un epifenómeno sin importancia. Esto ha cambiado con el descubrimiento de mutaciones en el gen de tau en algunas otras enfermedades neurodegenerativas relacionadas.

Aún no se ha establecido el mecanismo por el cual el Aº mata las neuronas en el cerebro. Se han realizado muchos estudios sobre la toxicidad de Aº en cultivos tisulares usando cultivos neuronales de cerebro de rata. Los presentes inventores han demostrado que la exposición de cultivos neuronales de cerebro tanto de fetos de rata como humanos a Aº agregado induce en 2 a 10 minutos aumentos en el contenido de fosfotirosina de varias proteínas, incluida tau (Williamson y col., 2002) . También han demostrado que este tratamiento tiene como 45 consecuencia la activación de las tirosina quinasas FAK y Fyn, siendo esta última un miembro de la familia src de tirosina quinasas. Esta fosforilación de tirosinas de la tau se previno mediante inhibidores que actúan sobre la familia src de tirosina quinasas y sobre c-Abl.

Se ha publicado previamente que los niveles elevados de Fyn se asocian con neuronas que contienen 50 tau fosforilada de forma anómala en el cerebro de pacientes con EA (Shirazi y Wood, 1993) y los presentes inventores han demostrado usando anticuerpos que reconocen fosfotirosina que PHF-tau de cerebro de pacientes con EA contiene fosfotirosina (Williamson y col., 2002) . Existen cinco posibles sitios de fosforilación de la tirosina en tau, que son los restos 18, 29, 197, 310 y 394, según la numeración de restos en las isoformas más largas de tau de 441 aminoácidos de cerebro humano. Los presentes inventores han demostrado in vitro que Fyn y Lck, ambas 55 quinasas de la familia src, fosforilan la proteína tau recombinante humana y que las fosfotirosinas 18, 197, 310 y 394 se identificaban positivamente en uno o más de sus respectivos péptidos trípticos, a partir de la información de la secuencia de los péptidos fragmentados (Scales y col., 2002) .

Las neuronas en los cortes de cerebro de ratones transgénicos en los que se ha interrumpido el gen Fyn son resistentes a la toxicidad de A (Lambert y col., 1998) . Por tanto, existen indicios de que la activación de Fyn puede estar implicada en la toxicidad de A .

Se ha descrito que el tratamiento de la microglía con A en cultivo tiene como consecuencia la activación de algunas otras tirosina quinasas, concretamente Syk, Lyn y FAK (McDonald y col., 1997) y, como se menciona anteriormente, los presentes inventores han encontrado que FAK también se activa en cultivos primarios de neuronas expuestas a A (Williamson y col., 2002) . Se ha descrito que Syk fosforila la a-sinucleína en la tirosina, siendo a-sinucleína la principal proteína de los cuerpos de Lewy que constituyen la característica patológica de la enfermedad de Parkinson y que también está presente hasta en el 70% de los cerebros de pacientes con EA (Negro y col., 2002) . Por último, los presentes inventores han encontrado que la proteína tirosina quinasa Abl fosforila la proteína tau en células cotransfectadas y que Abl está implicada en la activación de la proteína serina/treonina quinasa cdk5, que se considera una quinasa de tau importante a nivel patológico que fosforila muchos restos en tau y puede ser fosforilada alternativamente por GSK-3 (Zukerberg y col., 2000) . Por tanto, existe una elevada posibilidad de que tau sea sustrato de diversas tirosina quinasas y que sea necesario considerar a estas proteínas en el contexto de la posible patogénesis de las tauopatías.

La presencia de depósitos intraneuronales de tau en la forma de ovillos neurofibrilares típicos en la EA

o de otros agregados de tau morfológicamente distintos en otra serie de enfermedades neurodegenerativas, constituyen la base para agrupar estas afecciones como tauopatías. De este modo, además de la EA, los principales 20 ejemplos de tauopatías son la demencia frontotemporal con parkinsonismo ligado al cromosoma 17 (FTDP-17) , parálisis supranuclear progresiva (PSP) , enfermedad de Pick, degeneración corticobasal y atrofia multisistémica (AMS) . Los depósitos intracelulares de tau (normalmente neuronales, aunque también a veces gliales) son filamentosos y en estado hiperfosforilado en comparación con la fosforilación de la proteína tau en el cerebro humano control. En el caso de la EA, esta proteína tau hiperfosforilada a menudo se denomina PHF-tau porque deriva de los PHF.

Aparte de la EA, en estas otras tauopatías no hay depósitos de A en el cerebro o estos son mínimos. Existen algunas tauopatías con genealogía de enfermedad autosómica dominante en las que el gen causante se ha identificado como el gen tau y, aunque se pueden presentar algunos casos con la misma mutación en enfermedades 30 aparentemente diferentes, invariablemente tienen depósitos de tau en el cerebro y son principalmente de la variedad FTDP-17. Por consiguiente, el hallazgo de mutaciones en el gen tau causantes de enfermedad y depósitos de agregados de tau en las neuronas es un indicio convincente de la importancia patogénica principal del depósito de tau en todas estas afecciones, incluida la EA, cualquiera que sea la causa de la enfermedad. Por tanto, el descubrimiento de las mutaciones en tau corrobora la hipótesis de la cascada del amiloide y confirma que, de hecho,

la formación de ovillos neurofibrilares bien puede estar supeditada al depósito de A en la EA, pero que en las otras tauopatías en las que no hay depósitos de A , la patología tau debe estar desencadenada por algún otro acontecimiento principal. Las anomalías y el depósito de la proteína tau son por ello dianas terapéuticas importantes para todas las tauopatías, incluida la EA.

Tau es una fosfoproteína, pero aún queda por establecer de forma inequívoca la función de su fosforilación. Sin embargo, el aumento de la fosforilación de tau en varios restos de serina y treonina... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de cribado de sustancias que son capaces de inhibir la fosforilación de una proteína tau por una tirosina quinasa en el que la proteína tau comprende uno o más sitios de fosforilación, comprendiendo el 5 procedimiento:

a) poner en contacto al menos una sustancia candidata, la proteína tau y la tirosina quinasa en condiciones en las que la tirosina quinasa es capaz de fosforilar el sitio (o sitios) de la proteína tau en ausencia de la sustancia candidata;

b) determinar si la sustancia candidata inhibe la fosforilación y, opcionalmente en qué grado, de la proteína tau en uno o más sitios de la proteína tau por la tirosina quinasa; y

c) seleccionar la sustancia candidata que inhibe la fosforilación de la proteína tau en uno o más de los sitios; 15 en el que la tirosina quinasa es c-Abl.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína tau es un filamento helicoidal apareado tau.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la proteína tau es un fragmento o derivado de la proteína tau con la secuencia de aminoácidos de la figura 1.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína tau tiene más del 80% de identidad de secuencia con una proteína tau que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 1.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que c-Abl fosforila la proteína tau en uno o más sitios seleccionados entre el grupo compuesto por Y197, Y 310 e Y394 de la proteína tau.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que c-Abl fosforila la proteína tau en el sitio Y394 de la 30 proteína tau.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el procedimiento además comprende el cribado con la tirosina quinasa Fyn de compuestos candidatos capaces de inhibir la fosforilación de una proteína tau por la tirosina quinasa Fyn en el que la proteína tau comprende uno o más sitios de fosforilación,

comprendiendo el procedimiento:

a) poner en contacto al menos una sustancia candidata, la proteína tau y la tirosina quinasa Fyn en condiciones en las que la tirosina quinasa Fyn es capaz de fosforilar el sitio (o sitios) de la proteína tau en ausencia de la sustancia candidata;

b) determinar si la sustancia candidata inhibe la fosforilación y, opcionalmente en qué grado, de la proteína tau en uno o más sitios de la proteína tau por la tirosina quinasa Fyn; y

c) seleccionar la sustancia candidata que inhibe la fosforilación de la proteína tau en uno o más de los sitios.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que Fyn fosforila la proteína tau en uno o más sitios seleccionados entre el grupo compuesto por Y18 e Y310 de la proteína tau.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el procedimiento además

comprende el cribado con la tirosina quinasa Syk de compuestos candidatos capaces de inhibir la fosforilación de una proteína tau por la tirosina quinasa Syk en el que la proteína tau comprende uno o más sitios de fosforilación, comprendiendo el procedimiento:

a) poner en contacto al menos una sustancia candidata, la proteína tau y la tirosina quinasa Syk en condiciones 55 en las que la tirosina quinasa Syk es capaz de fosforilar el sitio (o sitios) de la proteína tau en ausencia de la sustancia candidata;

b) determinar si la sustancia candidata inhibe la fosforilación y, opcionalmente en qué grado, de la proteína tau en uno o más sitios de la proteína tau por la tirosina quinasa Syk; y

c) seleccionar la sustancia candidata que inhibe la fosforilación de la proteína tau en uno o más de los sitios.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que Syk fosforila la proteína tau en el sitio Y18 de la 5 proteína tau.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que en la etapa de determinar la presencia, ausencia o grado de fosforilación en un o más sitios de la proteína tau se emplea espectroscopía de masas o un agente de reconocimiento específico de sitio que es capaz de distinguir entre un sitio fosforilado o no fosforilado; en el que dicho agente de reconocimiento específico de sitio es un anticuerpo monoclonal.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el cribado se realiza en un ensayo multiplex empleando una fase sólida sobre la que se inmovilizan una gran variedad de sustratos y en el que el sustrato comprende fragmentos de la proteína tau que comprenden sitios de fosforilación.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que los sitios de fosforilación son uno o más de los sitios seleccionados entre el grupo compuesto por Y18, Y29, Y197, Y310 e Y394 de la proteína tau.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, comprendiendo el procedimiento de

identificación de una sustancia candidata como inhibidor de dicha tirosina quinasa, la etapa adicional de optimizar la estructura de la sustancia candidata.