Presentación de proteínas en la superficie de células de levadura y sus usos.

Método para seleccionar proteínas con propiedades fenotípicas mejoradas con respecto a las de esa proteína detipo silvestre,

que comprende las etapas de:

transformar las células de levadura con un vector que expresa una proteína a ensayar fusionada a unaproteína de pared celular de levadura, en el que se utiliza la mutagénesis para generar una poblaciónvariegada de mutantes de la proteína a ensayar;

marcar dichas células de levadura con un primer marcador, en el que dicho primer marcador se asocia conlas levaduras que expresan dicha proteína a ensayar y no se asocia con las levaduras que no expresan dichaproteína a ensayar;

aislar dichas células de levadura con las que se asocia dicho primer marcador;

analizar y comparar dichas propiedades fenotípicas de dicha proteína mutante expresada por una levaduraque tiene las propiedades fenotípicas de dicha proteína de tipo silvestre; y

seleccionar las células de levadura que presentan las proteínas mutantes con propiedades fenotípicasmejoradas frente a la proteína de tipo silvestre;

en el que las propiedades fenotípicas mejoradas son una o más de entre el nivel de expresión en superficie,la estabilidad, los niveles de secreción y la solubilidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención La presente invención se refiere en general a los campos de la inmunología y la química de proteínas. Más concretamente, la presente invención se refiere a la presentación de péptidos y proteínas en la superficie de células de levadura para la selección de secuencias con propiedades fenotípicas mejoradas a partir de genotecas combinatorias.

Descripción de los antecedentes de la técnica La estructura del sitio de combinación del anticuerpo puede predecirse con precisión razonable a partir de los datos de la secuencia polipeptídica, pero la capacidad para diseñar racionalmente mejoras en la afinidad y especificidad de unión ha demostrado ser más difícil de alcanzar, a pesar de algunos éxitos (por ejemplo, Roberts et al., '87;. Riechmann et al., ‘92) . Como resultado, la mutagénesis y el cribado de genotecas representa actualmente el abordaje más fructífero hacia la maduración dirigida de la afinidad de los anticuerpos. Los métodos de selección y cribado de genotecas combinatorias se han convertido en una herramienta común para modificar las propiedades de reconocimiento de las proteínas (Ellman et al., 1997, Phizicky & Fields, 1995) . En concreto, la construcción y el cribado de repertorios inmunitarios de anticuerpos in vitro prometen un mejor control sobre la potencia y la especificidad de las interacciones antígeno-anticuerpo.

La técnica más extendida es la presentación en bacteriófagos, mediante la cual la proteína de interés se expresa como polipéptido de fusión a una proteína de la cubierta del bacteriófago y posteriormente se criba mediante la unión al ligando biotinilado inmovilizado o soluble (por ejemplo, Huse et al., '89;. Clackson et al., '91;. Marks et al., '92) . Las fusiones se realizan más comúnmente a una proteína de recubrimiento menor, llamada proteína del gen III (pIII) , que está presente en una cantidad de tres a cinco copias en la punta del bacteriófago. Un bacteriófago construido de esta manera puede considerarse una "unidad" genética compacta, que posee tanto el fenotipo (la actividad de unión del anticuerpo presentado) y el genotipo (el gen que codifica ese anticuerpo) en un solo paquete. La presentación en bacteriófagos ha sido aplicada con éxito a anticuerpos, proteínas de unión a ADN, inhibidores de proteasas, péptidos cortos y enzimas.

Los anticuerpos que poseen propiedades de unión deseables se seleccionan mediante la unión a un antígeno inmovilizado en un proceso llamado “panning”. Los bacteriófagos que portan anticuerpos no específicos se eliminan mediante lavado y a continuación los bacteriófagos unidos se eluyen y se amplifican mediante infección de E. coli. Este abordaje se ha aplicado para generar anticuerpos contra muchos antígenos, inlcuidos: el antígeno de superficie de la hepatitis B (Zebedee et al., '92) ; polisacáridos (Deng et al., '94) , factor 1 de crecimiento insulinoide (Garrard y Henner, '93) , 2-feniloxazol-5-ona (Riechmann y Weill, '93) y ácido 4-hidroxi-5-yodo-3-nitro-fenacetil- (NIP) -caproico (Hawkins et al., '92) .

Sin embargo, la presentación en bacteriófagos tiene varias deficiencias. Aunque el “panning” de genotecas de anticuerpos de presentación en bacteriófagos es una tecnología de gran alcance, tiene varias dificultades intrínsecas que limitan su aplicación generalizada con éxito. Por ejemplo, algunas proteínas de la superficie celular y proteínas secretadas eucariotas necesitan modificaciones post-traduccionales tales como la glicosilación o una amplia isomerización de enlaces disulfuro que no están disponibles en las células bacterianas. Además, la naturaleza de la presentación en bacteriófagos excluye la discriminación cuantitativa y directa de los parámetros de la unión a ligando. Por ejemplo, los anticuerpos de afinidad muy alta (KD ≤ 1 nM) son difíciles de aislar medinate “panning”, ya que las condiciones de elución necesarias para romper una interacción antígeno-anticuerpo muy fuerte son generalmente lo suficientemente rigurosas (por ejemplo, pH bajo, alto contenido en sal) para desnaturalizar la partícula de bacteriófago lo suficiente como para hacerla no infecciosa. Además, el requisito para la inmovilización física de un antígeno en una superficie sólida produce muchos problemas artefactuales. Por ejemplo, la alta densidad superificial del antígeno introduce efectos de avidez que enmascaran la verdadera afinidad. Además, la inmovilización física reduce la entropía de traslación y de rotación del antígeno, lo que da como resultado una DS menor tras la unión del anticuerpo y una sobrevaloración del resultado de la afinidad de unión con respecto a la del antígeno soluble y los grandes efectos por la variabilidad en los procedimientos de mezcla y lavado conducen a dificultades de reproducibilidad. Además, la presencia de uno solo a unos pocos anticuerpos por partícula de bacteriófago introduce una variación estocástica sustancial y la discriminación entre los anticuerpos de afinidad similar se hace imposible. Por ejemplo, suelen ser necesarias diferencias de afinidad de 6 veces o más para una discriminación eficaz (Riechmann y Weill, '93) . Por último, las poblaciones pueden ser superadas por el bacteriófago de tipo silvestre de crecimiento más rápido. En concreto, puesto que pIII está directamente implicada en el ciclo vital del bacteriófago, la presencia de algunos anticuerpos o antígenos unidos evitará o retardará la amplificación del bacteriófago asociado.

Se han desarrollado varios métodos de presentación en la superficie celular bacteriana. Sin embargo, el uso de un sistema de expresión procariota introduce oasionalmente sesgos de expresión impredecibles y las capas de polisacáridos capsulares bacterianos presentan una barrera de difusión que restringe tales sistemas a ligandos de moléculas pequeñas (Roberts, 1996) . E. coli posee una cápsula o capa de lipopolisacárido que puede interferir estéricamente con las reacciones de unión macromolecular. De hecho, una presunta función fisiológica de la cápsula bacteriana es la restricción de la difusión de macromoléculas a la membrana celular, con el fin de proteger a la célula del sistema inmunitario (DiRienzo et al., ‘78) . Puesto que el periplasma de E. coli no ha evolucionado como compartimento para el plegamiento y ensamblaje de fragmentos de anticuerpos, la expresión de anticuerpos en E. coli ha sido por lo general muy dependiente del clon, expresándolos bien algunos clones y otros nada en absoluto. Tal variabilidad introduce preocupaciones acerca de la representación equivalente de todas las secuencias posibles en una genoteca de anticuerpos expresados en la superficie de E. coli.

El descubrimiento de nuevas tratamientos se vería facilitado por el desarrollo de sistemas de selección en levaduras. Las similitudes estructurales entre los linfocitos B que presentan anticuerpos y las células de levadura que presentan anticuerpos proporcionan una analogía más estrecha a la maduración de la afinidad in vivo que la disponible con el bacteriófago filamentoso. Por otra parte, la facilidad de cultivo y la facilidad de manipulación genética disponible con levadura permitirá mutagenizar y cribar rápidamente grandes poblaciones. A diferencia de las condiciones en el cuerpo de los mamíferos, pueden modificarse las condiciones físicoquímicas de unión y selección para un cultivo de levadura dentro de un amplio rango de pH, temperatura y potencia iónica, para proporcionar grados de libertad adicionales en los experimentos de diseño de anticuerpos. En el presente documento se ha descrito el desarrollo de un sistema de presentación en la superficie de levaduras para el cribado de genotecas combinatorias de anticuerpos y un cribado basado en la cinética de disociación antígeno-anticuerpo.

Las aplicaciones potenciales del diseño de anticuerpos monoclonales para el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades humanas son de gran alcance. En concreto, se han buscado activamente aplicaciones al tratamiento del cáncer y la obtención de imágenes de tumores. Los tratamientos con anticuerpos para la sepsis por gramnegativos todavía son prometedores a pesar de los desalentadores resultados preliminares. Las aplicaciones in vitro para la cromatografía de inmunoafinidad, inmunoensayo e inmunohistoquímica ya están bien desarrolladas. Para cada una de estas aplicaciones, resultan deseables anticuerpos con alta afinidad (es decir, KD ≤ 10 nM) y una alta especificidad. Pruebas empíricas sugieren que es poco probable que los sistemas de presentación en bacteriófagos o de presentación en bacterias produzcan sistemáticamente anticuerpos de afinidad subnanomolar. Hasta la fecha,... [Seguir leyendo]

1. Método para seleccionar proteínas con propiedades fenotípicas mejoradas con respecto a las de esa proteína de tipo silvestre, que comprende las etapas de:

transformar las células de levadura con un vector que expresa una proteína a ensayar fusionada a una proteína de pared celular de levadura, en el que se utiliza la mutagénesis para generar una población variegada de mutantes de la proteína a ensayar; marcar dichas células de levadura con un primer marcador, en el que dicho primer marcador se asocia con las levaduras que expresan dicha proteína a ensayar y no se asocia con las levaduras que no expresan dicha proteína a ensayar; aislar dichas células de levadura con las que se asocia dicho primer marcador; analizar y comparar dichas propiedades fenotípicas de dicha proteína mutante expresada por una levadura que tiene las propiedades fenotípicas de dicha proteína de tipo silvestre; y seleccionar las células de levadura que presentan las proteínas mutantes con propiedades fenotípicas mejoradas frente a la proteína de tipo silvestre; en el que las propiedades fenotípicas mejoradas son una o más de entre el nivel de expresión en superficie, la estabilidad, los niveles de secreción y la solubilidad.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha proteína a ensayar es un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo Fab, Fv o scFv.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicha proteína a ensayar es el dominio de unión a ligando de un receptor de superficie celular.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho receptor de superficie celular es un receptor de linfocitos T.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la proteína a ensayar está fusionada por su extremo N-terminal al extremo C-terminal de dicha proteína de pared celular de levadura.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la proteína de pared celular de levadura es una aglutinina.

7. Método según la reivindicación 1, en el que dicha levadura es de un género seleccionado del grupo que consiste en Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia y Candida.

8. Método según la reivindicación 1, en el que dichos mutantes de la proteína a ensayar están seleccionados del grupo que consiste en mutantes simples y mutantes múltiples.

9. Método según la reivindicación 1, en el que dicho primer marcador está seleccionado del grupo que consiste en marcadores fluorescentes y partículas magnéticas fijadas a un ligando para la proteína a ensayar.

10. Método según la reivindicación 1, en el que la selección de las proteínas mutadas de interés con propiedades fenotípicas mejoradas implica ciclos iterativos de dichas etapas de transformación y de puesta en contacto.

11. Método según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de:

poner en contacto dichas células de levadura con un segundo marcador, en el que dicho vector utilizado para transformar dichas células de levadura contiene medios para expresar una secuencia polipeptídica fusionada a dicha proteína a ensayar para producir un polipéptido de fusión y dicho segundo marcador se asocia con las células de levadura que expresan dicho polipéptido de fusión y no se asocia con las células de levadura que no expresan dicho polipéptido de fusión; enriquecer una población de levaduras transformadas cuantificando dicho segundo marcador, en el que una presencia de dicho segundo marcador es directamente proporcional a la abundancia de dichos polipéptidos de fusión expresados en la superficie celular; y comparar dicha cuantificación de dicho primer marcador con dicha cuantificación de dicho segundo marcador para determinar los niveles de expresión en superficie de dicha proteína a ensayar.

12. Método según la reivindicación 11, en el que puede utilizarse un aumento de dichos niveles de expresión en superficie de dicha proteína mutante a ensayar con respecto al nivel de expresión en superficie de la proteína de tipo silvestre ensayada para seleccionar las propiedades fenotípicas deseables de dicha proteína mutante, en el que dichas propiedades fenotípicas deseadas incluyen una o más de entre el nivel de expresión intracelular, la estabilidad, los niveles de secreción y la solubilidad.

13. Método según la reivindicación 11, en el que dicha porción polipeptídica de dicho polipéptido de fusión reconocida por dicho segundo marcador es un epítopo de identificación.

14. Método según la reivindicación 11, en el que dicho primer marcador y dicho segundo marcador son marcadores fluorescentes.

5 10 15 20 25 15. Método según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de: clonar un gen que codifica dichas proteínas mutantes seleccionadas en un vector adaptado para la expresión en una célula eucariota; y expresar dicha proteína mutante en dicha célula eucariota, en el que dichas propiedades fenotípicas mejoradas de dicha proteína mutante se confirman comparando las propiedades de dichas propiedades fenotípicas mejoradas de dicha proteína mutante con las propiedades de dicha proteína de tipo silvestre. 16. Método según la reivindicación 15, en el que dicha célula eucariota está seleccionada del grupo que consiste en células de levadura, de insecto y de mamífero. 17. Método según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de: clonar un gen que codifica dichas proteínas mutantes seleccionadas en un vector adaptado para la expresión en un procariota; y expresar dicha proteína mutante en dicho procariota, en el que dichas propiedades fenotípicas mejoradas de dicha proteína mutante se confirman comparando las propiedades de dichas propiedades fenotípicas mejoradas de dicha proteína mutante con las propiedades de dicha proteína de tipo silvestre. 18. Método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de aislamiento se lleva a cabo mediante citometría de flujo.

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