Polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican los mismos.

Polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa y afinidad de enlace de carbohidrato,

donde dicho polipéptidocomprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad con los aminoácidos 1 a 586 de SEQ ID Nº: 2.

Polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican los mismos Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden los constructos de ácidos nucleicos al igual que a métodos para producir y usar los polipéptidos.

Antecedentes de la invención [0002] Durante años, las enzimas de alfa-amilasa se han usado para una variedad de fines diferentes, los más importantes de ellos son la licuefacción de almidón, el desencolado textil, la modificación de almidón en la industria del papel y de la pulpa y la elaboración de cerveza y el horneado. Otro uso de las alfa-amilasas es la eliminación de manchas amiláceas durante el lavado con un detergente de pH alcalino.

La WO2002/068589 divulga polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican las alfa-amilasas. Además, también se proporciona el diseño de nuevas alfa-amilasas y métodos de uso de las mismas. Las alfa-amilasas aumentan su actividad y su estabilidad en pH acídico y alcalino y en temperatura aumentada. Es un objeto de la presente invención proporcionar alfa-amilasas con un rendimiento adecuado para aplicaciones específicas.

Resumen de la invención [0004] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido con actividad de alfa-amilasa y afinidad de enlace a carbohidratos, donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad con los aminoácidos 1 a 586 de SEQ ID Nº: 2.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia de los nucleótidos 100 a 1857 de SEQ ID Nº: 1 y codifica para el polipéptido de la invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de la invención, operativamente enlazado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos de la invención.

En un sexto aspecto, la presente invención se refiere al uso del polipéptido de la invención o una composición de la invención para tratar tejidos, telas, hilo o prendas, por ejemplo, para el desencolado de tejidos, telas, hilos o prendas.

La invención también se refiere al uso de un polipéptido de la invención para licuefacción de almidón y en la producción de etanol.

Otros aspectos de la presente invención se harán evidentes a partir de la descripción siguiente y de las reivindicaciones anexas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la consistencia de la miga de pan durante 21 días de almacenamiento con y sin AMY1048 de la invención y/o alfa-amilasa maltogénica.

La figura 2 muestra la elasticidad de la miga de pan durante 21 días de almacenamiento con y sin AMY1048 de la invención y/o alfa-amilasa maltogénica.

La figura 3 muestra el efecto de AMY1048 de la invención en la cantidad de agua libre con y sin AMY1048 de la invención y/o alfa-amilasa maltogénica. La clasificación de la pequeña evaluación sensorial se da en círculos junto a cada curva. La clasificación máxima se da al pan más húmedo.

Definiciones [0013] Antes de discutir la presente invención con más detalle, se definirán primero los siguientes términos y usos:

Polipéptido substancialmente puro: en el presente contexto, el término "polipéptido substancialmente puro" se refiere a una preparación polipeptídica que contiene como mucho 10% en peso de otro material polipeptídico con el cual está originalmente asociado (se prefieren porcentajes inferiores de otro material polipeptídico, por ejemplo, como mucho 8% en peso, como mucho 6% en peso, como mucho 5% en peso, como mucho 4%, como mucho 3% en peso, como mucho 2% en peso, como mucho 1% en peso y como mucho 0, 5% por peso) . Así, se prefiere que el polipéptido substancialmente puro sea al menos 92% puro, es decir, que el polipéptido constituya al menos 92% en peso del material polipeptídico total presente en la preparación, y se prefieren porcentajes más altos, tales como al menos 94% puro, al menos 95% puro, al menos 96% puro, al menos 96% puro, al menos 97% puro, al menos 98% puro, al menos 99% y como mucho 99, 5% puro. Los polipéptidos descritos en la presente están preferiblemente en una forma substancialmente pura. En particular, se prefiere que los polipéptidos descritos en la presente estén en "forma esencialmente pura", es decir, que la preparación polipeptídica esté esencialmente libre de otro material polipeptídico con el cual esté originalmente asociado. Esto se puede conseguir, por ejemplo, por la preparación del polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos. Aquí, el término "polipéptido substancialmente puro" es sinónimo de los términos "polipéptido aislado" y "polipéptido en forma aislada".

Actividad de alfa-amilasa: las alfa-amilasas (alfa 1, 4-alfa-D-glucano glucanohidrolasas, EC 3, 2, 1, 1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de almidón y otros oligo y polisacáridos 1, 4 glucosídicos ramificados y lineales. Para fines de la presente invención, la actividad de alfa-amilasa se determina usando el ensayo de PHADEBAS® o el ensayo pNPG7, descritos más adelante en la sección "Materiales y métodos".

Los polipéptidos de la presente invención deberían tener preferiblemente al menos 20% de la actividad de alfaamilasa del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos en la posición 1 a 586 de SEQ ID Nº: 2.

En una forma de realización preferida particular, los polipéptidos deberían tener al menos 40%, tal como al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, tal como al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, tal como al menos 90%, de la forma más preferible al menos 95%, tal como aproximadamente o al menos 100% de la actividad de alfa-amilasa del polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada como los aminoácidos en la posición 1 a 586 de SEQ ID Nº: 2.

Identidad: en el presente contexto, la homología entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad".

Para fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el programa FASTA incluido en la versión 2.0x del paquete de programa FASTA (véase W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988) , "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98) . La matriz de puntuación usada fue BLOSUM50, la penalización de espacio fue -12 y la penalización de extensión del espacio fue -2.

El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el mismo algoritmo y paquete de software que se ha descrito anteriormente. La matriz de puntuación usada fue la matriz de identidad, la penalización de espacio fue -16 y la penalización de extensión del espacio fue -4.

Fragmento: cuando se usa en este caso, un "fragmento" de SEQ ID Nº: 2 son los polipéptidos que tienen uno o más aminoácidos eliminados del amino y/o carboxilo terminal de esta secuencia de aminoácidos.

Variante alélica: en el presente contexto, el término "variante alélica" denota cualesquiera dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación y puede resultar en polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

Polinucleótido substancialmente puro: el término "polinucleótido substancialmente puro", como se utiliza en este caso, se refiere a una preparación polinucleótida donde el polinucleótido ha sido... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido que tiene actividad de alfa-amilasa y afinidad de enlace de carbohidrato, donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 99% de identidad con los aminoácidos 1 a 586 de SEQ 5 ID Nº: 2.

2. Polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia de los nucleótidos 100 a 1857 de SEQ ID Nº: 1 y codifica para el polipéptido definido en la reivindicación 1.

3. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 2, operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

4. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 3. 15

5. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 3 o vector de expresión recombinante definido en la reivindicación 4.

6. Composición que comprende el polipéptido según la reivindicación 1 y, opcionalmente, una o más enzimas

seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, tal como una endoglucanasa, una lipasa, una cutinasa, una oxidorreductasa, una proteasa, otra amilasa, una hemicelulasa, tal como una mananasa, una xilanasa, una galactanasa, una arabinofuranosidasa, una esterasa, una liquenasa, una arabinanasa, una pectato liasa y una mezcla de las mismas.

7. Uso del polipéptido según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 6 para tratar tejidos, telas, hilo 25 o prendas, por ejemplo, para desencolado de tejidos, telas, hilo o prendas.

8. Uso del polipéptido según la reivindicación 1 en masas, por ejemplo, para mejorar la elasticidad, la consistencia, la blandura y/o la humedad de la miga de pan de un producto de horneado.

9. Uso del polipéptido según la reivindicación 1 en una composición de detergente, en particular una composición de detergente para lavado de ropa y una composición de detergente para lavado de vajilla.

10. Uso del polipéptido según la reivindicación 1 para licuefacción de almidón.

11. Uso del polipéptido según la reivindicación 1 en la producción de etanol.