Polipéptido termoestable con actividad penicilina acilasa, variantes del mismo y sus aplicaciones.

Polipéptido termoestable con actividad penicilina acilasa, variantes del mismo y sus aplicaciones.

Se describe un polipéptido termoestable con actividad penicilina acilasa y variantes funcionalmente equivalentes del mismo, un procedimiento para su obtención y su empleo en la producción de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA).

Polipéptido termoestable con actividad penicilina acilasa, variantes del mismo y sus aplicaciones.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un polipéptido termoestable con actividad penicilina acilasa, variantes del mismo y a sus aplicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La penicilina acilasa (PAC) es una de las enzimas más relevantes en la industria farmacéutica. Participa en la producción de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) , que se usa posteriormente en la síntesis química de nuevas lactamas con mayor eficacia clínica. Las PACs pertenecen a la familia de hidrolasas de nucleófilos N-terminal, cuyos miembros experimentan un proceso de maduración complejo. En este proceso, se sintetiza la pre-pro-proteína como un polipéptido que se transloca al periplasma con la eliminación simultánea del péptido señal. La pro-proteína resultante se autoproteoliza entonces en el periplasma, produciendo el polipéptido que constituye la sub-unidad 1 y un segundo polipéptido. Éste, sufre una segunda proteolisis y genera el polipéptido que constituye la sub-unidad a y descubriendo el sitio activo mediante la eliminación de un péptido espaciador. La precisión del proceso de maduración es extremadamente relevante para la funcionalidad de la enzima heterodimérica final (sub-unidades polipeptídicas a más 1) .

Industrialmente, la penicilina G acilasa (PGA) de Escherichia coli es la enzima más utilizada, ya sea recombinante o nativa. Aunque la temperatura óptima para la hidrólisis de la penicilina G es de 50ºC, dicha enzima PGA de E. coli pierde estabilidad por encima de 30ºC y debe usarse en forma inmovilizada para incrementar su actividad. Otras PGA descritas con superior estabilidad son las de Alcaligenes faecalis (AfaePGA, t1/2 de 15 min a 55ºC) , Bacillus badius (t1/2 de 20 min a 55ºC) y Achromobacter xylosoxidans (t1/2 de 55 min a 55ºC) . Su termoestabilidad surge de diferentes motivos tales como puentes disulfuro adicionales, más puentes salinos o pares iónicos enterrados adicionales, respectivamente. Sin embargo, la eficiencia del proceso catalítico industrial podría mejorarse enormemente mediante el uso de enzimas con una vida media más larga en las condiciones de reacción regularmente usadas.

Las enzimas aisladas de termófilos extremos (termozimas) muestran una temperatura óptima similar a la de la velocidad de crecimiento máxima de su organismo de procedencia. Además, las termozimas presentan una resistencia a la desnaturalización química provocada, por ejemplo, por disolventes orgánicos, detergentes o pH, superior al promedio. En términos generales, la fermentación del huésped termófilo natural no es económicamente viable debido a los requisitos nutritivos y de energía del proceso, y se prefiere habitualmente la expresión de la proteína de interés en un sistema heterólogo. Sin embargo, la expresión recombinante de proteínas de termófilos en mesófilos supone frecuentemente un desafío. De hecho, se estima que menos del 20% de los ORF (del inglés “Open reading frame” o marco abierto de lectura) de cualquier genoma de hipertermófilo o termófilo extremo puede expresarse y dar lugar a un polipétido correctamente plegado en E. coli. Las estrategias para mejorar el plegamiento de termozimas expresadas de manera recombinante en E. coli incluyen el crecimiento del huésped a una temperatura superior, replegamiento de la proteína desnaturalizada en presencia de cofactores o co-expresión con chaperonas de E. coli.

Por tanto, existe la necesidad de encontrar nuevas enzimas con actividad penicilina acilasa que presenten estabilidad a elevadas temperaturas y que puedan expresarse en organismos mesófilos.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han clonado y sobreexpresado satisfactoriamente el gen pac de Thermus thermophilus (Tth) en células de E. coli bajo el control de un promotor del bacteriófago T7. La proteína recombinante producida ha sido caracterizada bioquímicamente como una penicilina K acilasa, con una temperatura óptima de reacción de 75ºC. Por tanto, dicha proteína puede actuar como un catalizador extremadamente estable adecuado para la producción industrial de penicilinas semisintéticas.

Por tanto, en un aspecto la invención se relaciona con un polipéptido con actividad penicilina acilasa que comprende la SEQ ID NO: 1, o una variante funcionalmente equivalente del mismo, con la condición de que dicho polipéptido no es el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO:

2.

En un segundo aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión que comprende (i) . un polipéptido A que comprende un polipéptido según la invención y

(ii) . un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B es un polipéptido diferente a dicho polipéptido A.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o una proteína de fusión proporcionados por la presente invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende un polinucleótido proporcionado por la presente invención.

En otro aspecto la invención se relaciona con un vector que comprende un polinucleótido o una construcción génica proporcionada por la presente invención. En una realización particular, dicho vector es un vector de expresión.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un organismo que comprende un polinucleótido, una construcción génica, o un vector, proporcionados por la presente invención. En una realización particular, dicho organismo es un organismo mesófilo, por ejemplo, una bacteria mesófila.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para obtener un polipéptido o una proteína de fusión proporcionados por la presente invención que comprende cultivar un organismo proporcionado por esta invención que comprende un polinucleótido proporcionado por la presente invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido o dicha proteína de fusión, y, si se desea, recuperar dicho polipéptido o proteína de fusión. En una realización particular, dicho organismo es un organismo mesófilo, por ejemplo, una bacteria mesófila.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) que comprende poner en contacto una penicilina con un grupo carboxamida hidrofóbico unido a la posición 6 del anillo penam a través del átomo de nitrógeno, con un polipéptido o con una proteína de fusión proporcionados por la presente invención bajo condiciones que permitan la hidrólisis de dicha penicilina.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido proporcionado por la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Presencia de la proteína PAC en células de Tth (Thermus thermophilus) . Se separaron las proteínas totales de células de Tth de las cepas HB27 y NAR1 mediante SDS-PAGE y se determinó individualmente la presencia de sub-unidades α-PAC y β-PAC mediante ensayos de inmunotransferencia de tipo Western.

Figura 2. Ubicación subcelular de TthPAC. Se tomaron imágenes de microscopía confocal de fluorescencia de cultivos exponenciales de la cepa mutante Tth HB27 Δpac que albergaba las fusiones de proteínas β-glicosidasa-sGFP utilizada como marcador citosólico (A) , ΔSpTthPAC-sGFP (B) , TthPACsGFP (C) o SpTthPAC-sGFP (D) .

Figura 3. Inmunodetección de TthPAC en la fracción de membrana. Se analizó la presencia de las subunidades α-PAC y β-PAC y de la proteína periplásmica DrpA en la fracción de membrana (MB) , la fracción soluble (SB) y la fracción periplásmica (PE) de cuerpos multicelulares Tth NAR1 ΔslpA mediante ensayos de inmunotransferencia de tipo Western.

Figura 4. Solubilización de la membrana interna de Tth e inmunodetección de TthPAC. Se inmunodetectó PAC en membranas aisladas de Tth HB27 tras un tratamiento de 30 min con sarkosyl (Nlauroilsarcosinato de sodio) , a 37ºC. T, membranas totales; P, fracción de membrana insoluble tras el tratamiento con detergente; SB, fracción de proteínas solubles tras el tratamiento con detergente. SlpA, marcador de proteína de la membrana externa; Nqo6, marcador de proteína de la membrana interna.

Figura 5. Ensayos de accesibilidad de tripsina. Se inmunodetectaron las sub-unidades α y β de TthPAC en la cepa Tth NAR1 ΔslpA antes del tratamiento con tripsina (C) , y tras una digestión con 1, 2 mg/ml de tripsina (1) o con 5, 5 mg/ml... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido con actividad penicilina acilasa que comprende la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente del mismo, con la condición de que dicho polipéptido no es el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 2.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende al menos una mutación puntual en relación con la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 1, que consiste en la sustitución de un aminoácido presente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 por otro aminoácido, en donde dicho aminoácido presente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 se selecciona del grupo formado por la leucina en posición 151 (Leu 151) , la serina en posición 152 (Ser 152) , la leucina en posición 242 (Leu 242) y/o la isoleucina en posición 275 (Ile 275) .

3. Polipéptido según la reivindicación 2, en el que al menos uno de dichos aminoácidos Leu 151, Ser 152, Leu 242 y/o Ile 275 es sustituido por un aminoácido aromático.

4. Polipéptido según la reivindicación 3, en el que dicho aminoácido aromático es fenilalanina.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polipéptido es estable a una temperatura comprendida entre 57, 5ºC y 82, 5ºC.

6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que presenta una temperatura óptima de actividad penicilina acilasa a aproximadamente 75 ºC.

7. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho polipéptido es estable a un pH comprendido comprendido entre 3 y 9.

8. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que presenta un pH óptimo de actividad penicilina acilasa en presencia de penicilina K a aproximadamente pH 4.

9. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que presenta un pH óptimo de actividad penicilina acilasa en presencia de penicilina G a aproximadamente pH 8.

10. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que hidroliza una penicilina con un grupo carboxamida hidrofóbico unido a la posición 6 del anillo penam a través del átomo de nitrógeno.

11. Polipéptido según la reivindicación 10, en donde dicha penicilina con un grupo carboxamida hidrofóbico unido a la posición 6 del anillo penam a través del átomo de nitrógeno se selecciona del grupo formado por penicilina K, penicilina F, penicilina dihidro F, penicilina V y penicilina G.

12. Una proteína de fusión que comprende:

i) un polipéptido A que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y

ii) un polipéptido B, en donde dicho polipéptido B es un polipéptido diferente a dicho polipéptido A.

13. Proteína de fusión según la reivindicación 12, en la que dicho polipéptido B es un péptido señal de secreción extracelular o un polipéptido útil para aislar y/o purificar proteínas.

14. Proteína de fusión según la reivindicación 12 ó 13, en la que dicho polipéptido B se selecciona del grupo formado por una cola de histidinas, una cola de argininas, FLAG-tag, Strep-tag, x-myc-tag, SBP-tag, S-tag, péptido de unión a calmodulina, dominio de unión a celulosa, dominio de unión a

quitina, glutatión S-transferasa-tag, proteína de unión a maltosa, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, βgalactosidasa y VSV-glicoproteína.

15. Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.

16. Una construcción génica que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15.

17. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15 o una construcción génica según la reivindicación 16.

18. Vector según la reivindicación 17, en el que dicho vector es un vector de expresión.

19. Un organismo que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15, una construcción génica según la reivindicación 16, o un vector según la reivindicación 16 ó 17.

20. Organismo según la reivindicación 19, en el que dicho organismo es un organismo mesófilo.

21. Organismo según la reivindicación 20, en el que dicho organismo mesófilo es una bacteria mesófila.

22. Un procedimiento para obtener un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, que comprende cultivar un organismo que comprende un polinucleótido según la reivindicación 15 bajo condiciones que permiten la producción de dicho polipéptido o dicha proteína de fusión, y, si se desea, recuperar dicho polipéptido o proteína de fusión.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicho organismo es un organismo mesófilo.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicho organismo mesófilo es un organismo mesófilo procariota.

25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho organismo es Escherichia coli.

26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 que comprende producir dicho polipéptido o dicha proteína de fusión junto con una proteína del sistema de chaperonas.

27. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que dicha proteína del sistema de chaperonas es una proteína seleccionada del grupo formado por DnaK/J, GrpE, factor desencadenante y GroEL/ES.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que dicha proteína del sistema de chaperonas es DnaK/J y/o GrpE.

29. Procedimiento según la reivindicación 26, en el que las proteínas del sistema de chaperonas son GroEL/ES.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, en el que la producción del polipéptido o proteína de fusión comprende el cultivo de dicho organismo en presencia de Ca2+.

31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que el Ca2+ está presente a una concentración comprendida entre mayor que 0 y 50 mM.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que el Ca2+ está presente a una concentración de aproximadamente 10 mM.

33. Un método para obtener ácido 6-aminopenicilánico (6-APA) que comprende poner en contacto una penicilina con un grupo carboxamida hidrofóbico unido a la posición 6 del anillo penam a través del átomo de nitrógeno con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o con una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13 bajo condiciones que permitan la hidrólisis de dicha penicilina.

34. Método según la reivindicación 33, en el que dicha penicilina con un grupo carboxamida hidrofóbico unido a la posición 6 del anillo penam a través del átomo de nitrógeno se selecciona del grupo formado por penicilina K, penicilina F, penicilina dihidro F, penicilina V y penicilina G.

35. Un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

36. Anticuerpo según la reivindicación 35, que reconoce específicamente la sub-unidad alfa de dicho polipéptido, en donde dicha sub-unidad alfa se sitúa entre el aminoácido en posición 1 y el aminoácido en posición 218 en la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 1.

37. Anticuerpo según la reivindicación 35, que reconoce específicamente la sub-unidad beta de dicho polipéptido, en donde dicha sub-unidad beta se sitúa entre el aminoácido en posición 219 y el aminoácido en posición 739 en la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID NO: 1.

Fig. 1

Fig. 2 Fig. 3

Fig. 4 Fig. 5

Fig. 6 Fig. 7

Fig. 8 Fig. 9

Fig. 10 Fig. 11

Fig. 12 A

Fig. 13 Fig. 14

Fig. 15