Polipéptido del Factor VIII.

Un polipéptido del Factor VIII de cadena sencilla que comprende una deleción interna de aminoácidos entreel residuo 741 y el residuo 1688,

con referencia a la secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitudcompleta SEQ ID NO: 1, en donde la deleción interna es de las posiciones de aminoácidos 746 a 1649, 746 a 1652,746 a 1655, 758 a 1649, 758 a 1652, 758 a 1655, 765 a 1649, 765 a 1652 o 765 a 1655.

Polipéptido del Factor VIII

Campo de la invención:

La presente invención se refiere a polipéptidos del Factor VIII que son más estables que el Factor VIII de longitud completa. La invención se refiere adicionalmente a una estructura artificial de ácido nucleico que incluye ADN que codifica el polipéptido del Factor VIII.

Antecedentes generales y estado de la técnica:

La hemofilia A es el resultado del déficit cuantitativo o cualitativo de Factor VIII (FVIII) , que requiere una sustitución exógena con preparaciones de derivados de FVIII plasmáticos o recombinantes. FVIII tiene una organización en dominios A1-A2-B-A3-C1-C2 y se sintetiza como una glicoproteína de cadena sencilla de 2351 aminoácidos de 280 kDa (Eaton, D. et al., 1986, Biochemistr y 25: 505-512; Toole, J. J. et al., 1984, Nature 312: 342; Vehar, G. A. et al., 1984, Nature 312: 337) . Aunque los dominios A y C muestran una identidad de aminoácidos del 35-40% entre sí y con los dominios A y C del factor de coagulación V, el dominio B no es homólogo a ninguna proteína conocida. Un procesamiento intracelular, proteolítico después del residuo Arg-1648 dentro del dominio B genera una cadena ligera de 80 kDa (dominios A3-C1-C2) y una cadena pesada de tamaño heterogéneo de 90-200 kDa (dominios A1-A2-B) . Las cadenas pesada y ligera se asocian como un heterodímero a través de un enlace dependiente de iones metálicos divalentes entre los dominios A1 y A3. En el plasma, FVIII circula como una forma inactiva unida al factor de von Willebrand (vWF) y para su activación requiere una escisión proteolítica mediante trombina o Factor Xa (Eaton, D., et al., 1986, Biochemistr y 25: 505-512; Girma, J. P. et al., 1987, Blood 70: 605-611; Koedam, J. A. et al., 1990, Eur. J. Biochem. 189: 229-234) . La escisión con trombina después de los residuos de Arg (R) 372, 740 y 1689, activa la actividad coagulante de FVIII, lo que produce la eliminación completa del dominio B. El heterotrímero FVIIIa resultante conserva el enlace dependiente de iones metálicos entre las subunidades A1 y A3-C1-C2, mientras que A2 se asocia con afinidad débil mediante interacciones electrostáticas (Eaton, D. et al., 1986, Biochemistr y 25: 505-512; Fay,

P. J. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 8957-8962; Pittman, D. & Kaufman, R. J. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2429-2433) .

Gracias a una mejor comprensión de la biosíntesis, la estructura y la función de FVIII, unos estudios han intentado producir moléculas de FVIII mejoradas para la terapia de reemplazo en pacientes con hemofilia A. Estrategias investigadas hasta la actualidad incluyen la deleción o la modificación de secuencias de FVIII, lo que ha dado como resultado una expresión más eficaz. Estudios previos sobre los requisitos para una actividad funcional de FVIII, demostraron que la escisión después de los residuos de Arg 372 y 1689 era necesaria en ambos sitios para una activación de FVIII y que el dominio B no era necesario para la actividad funcional (Eaton, D. L. et al., 1986, Biochemistr y 25: 8343; Burke, R. L. et al., 1986, J. Biol. Chem 261: 12574; Toole, J. J. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5939) . Con el fin de comprobar esta hipótesis, se realizaron varias metodologías tales como la deleción en el ADN complementario (ADNc) , de grandes fragmentos de ADN correspondientes al dominio B, proporcionando derivados de FVIII más cortos (Eaton, D. L. et al., 1986, Biochemistr y 25: 8343; Burke, R. L. et al., 1986, J. Biol. Chem 261: 12574) y se sometieron a ensayo para determinar su actividad coagulante.

El documento de solicitud PCT WO 86/06101 describe que las proteínas FVIII recombinantes con deleciones de hasta 880 aminoácidos en la región central todavía muestran actividad de FVIII. Además, Eaton et al., 1986, Biochemistr y 25:8343-8347, describen que un polipéptido en el que se han eliminado 766 aminoácidos (desde 797 hasta 1562) de la región del dominio B central, también conserva la actividad de FVIII. Estos derivados de FVIII con deleción del dominio B conservan un sitio de procesamiento proteolítico intracelular dentro del dominio B después del residuo Arg-1648, que se traduce en la generación de derivados heterogéneos de FVIII que comprenden una cadena sencilla o un complejo de dos productos de escisión proteolítica de FVIII, un polipéptido de 90 kDa (dominios A1-A2) y uno de 80 kDa (dominios A3-C1-C2) . Además, células de mamífero transformadas con un vector que contiene ADN que codifica este polipéptido con deleción, tenían un nivel de producción más alto que las células transformadas con un vector que contenía ADN que codificaba el polipéptido de longitud completa. Sin embargo, estos derivados de FVIII con el dominio B delecionado muestran tasas de activación mediante trombina más rápidas y superiores que FVIII de longitud completa, por mecanismos desconocidos (Eaton et al., 1986, Biochemistr y 25:8343-8347; Fay et al., 1986, Biochem. Biophys. Acta 871:268-278) .

El documento de Patente de EE.UU. nº 5.112.950 describe un derivado de FVIII en el que un derivado de FVIII humano que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos desde alanina-1 hasta aspartato-770 está unido a treonina-1667 a través de tirosina-2332, en donde aspartato-770 está unido covalentemente a través de un enlace peptídico a treonina-1667. Una variedad de estudios indican que los residuos de tirosina en las posiciones 346, 718, 719, 723, 1664 y 1680 son necesarios para la activación completa y la actividad procoagulante del FVIII (Donath M.J. et al., 1995, Biochem. J. 312: 49-55; Michnick D.A. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:20095-200102) . El FVIII que circula en el plasma se combina con vWF, que parece que lo estabiliza; en efecto, la semivida de FVIII in vivo disminuye muy rápidamente en ausencia de vWF (Brinkhous, K. M. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 87528756) . Estos estudios sugieren firmemente que análogos del Factor VIII con el dominio B delecionado (descritos en el documento de Patente de EE.UU. nº 5.112.950, en particular) , con alteraciones estructurales aproximadamente desde 1664 a 1680 en la región A3, pueden tener desventajas potenciales en cuanto a una activación total y una estabilidad in vivo debido a una interferencia con la interacción de vWF. Tal y como se describe en el documento de Patente de EE.UU. nº 5.610.278, la coexpresión de las cadenas pesada y ligera en células de mamífero da como resultado una producción detectable de FVIII. Sin embargo, la combinación de las dos cadenas es ineficaz, disminuyendo de ese modo la actividad de la molécula (Burke, R. L. et al., 1986, J. Biol. Chem. 261, 12574; Pavirani A. et al., 1987, Biochem Biophys Res Commun. 145:234) . La estrategia de la coexpresión de cadenas pesadas y ligeras como una metodología de terapia génica en animales o seres humanos no es adecuada (Burton M et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:12725) .

Los documentos de Patentes de EE.UU. nº 5.422.260 y 5.451.521 se refieren a variantes de FVIII, en donde se modifica uno o varios de los sitios de escisión de Factor Xa, APC y trombina para que dichos sitios sean menos lábiles frente a una proteolisis específica, por ejemplo, en donde uno o ambos de los aminoácidos que definen el sitio de escisión, preferiblemente al menos los residuos de arginina en R-740 o R-1648, se sustituyen por un aminoácido diferente; y en donde se describe la proteína con deleción de aminoácidos desde S-741 hasta R-1648 (fusionando R740 del sitio de 90 kDa con E-1649 del sitio de 80 kDa) , pero no se revela su actividad coagulante. El inconveniente potencial de esta modificación en los sitios de escisión con un aminoácido diferente es que la proteína resultante tendría un nuevo epítopo para provocar potencialmente una respuesta inmunológica. Además, las referencias no proporcionan variantes especificadas con una deleción interna de aminoácidos entre R-740 y R-1689, excepto para la que tiene una deleción interna de aminoácidos desde S-741 hasta R-1648.

Estudios recientes (Chiang GG et al., 1999, Human Gene Therapy 10:61-76) muestran que el FVIII con el dominio B delecionado que se genera mediante la deleción de aminoácidos desde S-743 hasta R-1648 (fusionando F-742 del extremo N-terminal del dominio B con E-1649 del sitio de 80 kDa) que es similar al descrito en los documentos de Patentes de EE.UU. nº 5.422.260 y 5.451.521, mostraba solo º50% de actividad biológica y menos actividad específica y, por lo tanto, se consideró menos adecuado para una aplicación terapéutica. La razón por la que un FVIII con el dominio B delecionado de este tipo posee menos actividad biológica y específica sigue siendo desconocida. Sin embargo, se supone que la naturaleza de FVIII de cadena sencilla con una deleción... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido del Factor VIII de cadena sencilla que comprende una deleción interna de aminoácidos entre el residuo 741 y el residuo 1688, con referencia a la secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitud completa SEQ ID NO: 1, en donde la deleción interna es de las posiciones de aminoácidos 746 a 1649, 746 a 1652,

746 a 1655, 758 a 1649, 758 a 1652, 758 a 1655, 765 a 1649, 765 a 1652 o 765 a 1655.

2. El polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, en donde la prolina en la posición 739 se sustituye por fenilalanina.

3. El polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la secuencia tripeptídica (Asn-X-Thr o Asn-X-Ser, en donde X es cualquier aminoácido) que incluye los sitios de fusión entre el aminoá

cido Asn en las posiciones 745, 757 o 764, y el aminoácido Thr o Ser en las posiciones 1651, 1654 o 1657, con referencia a la secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitud completa (SEQ ID NO: 1) .

4. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable de la misma.

5. Una composición liofilizada que comprende el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1.

6. Un uso de una composición farmacéutica que comprende el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento para la coagulación de la sangre.

7. Un uso de una composición farmacéutica que comprende el polipéptido del Factor VIII según la reivindica

ción 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento para el trata20 miento de la hemofilia A.

8. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1.

9. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8, ligado funcionalmente a un promotor.

10. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión según la reivindicación 9.

11. Un método para preparar el polipéptido del Factor VIII según la reivindicación 1, que comprende cultivar la célula según la reivindicación 10 en condiciones adecuadas para que el vector exprese el polipéptido, y aislar el polipéptido.