Plantas resistentes a enfermedad.

Planta de lechuga que es resistente a Bremia lactucae, caracterizado porque la planta tiene un nivel reducido,

actividad reducida o ausencia completa de proteína DMR6 en comparación con la planta que no es resistente adicho patógeno donde

dicha planta tiene una mutación en su gen DMR6 que da como resultado una proteína DMR6 con actividadenzimática reducida en comparación con la proteína DMR6 codificada por el gen DMR6 tipo natural en el que noestá presente tal mutación; o

dicha planta tiene una mutación en su gen DMR6 que da como resultado una expresión DMR6 reducida encomparación con el gen DMR6 tipo natural donde no está presente tal mutación.

Plantas resistentes a enfermedad

La presente invención se refiere a plantas de lechuga resistentes a enfermedad, en particular a plantas resistentes a organismos del reino Fungi y el filo Oomycota, los oomycetes. La invención además se refiere a métodos de obtención de tales plantas resistentes a enfermedad para proporcionar protección a patógenos Oomycota.

La resistencia de las plantas a patógenos fúngicos y oomycetes ha sido exhaustivamente estudiada, para tanto resistencia general como específica a patógeno. En muchos casos la resistencia está especificada mediante genes dominantes. Se ha identificado que muchos de estos genes de resistencia específica a raza o gen-a-gen median el reconocimiento al patógeno al interactuar directamente o indirectamente con productos del gen de avirulencia u otras moléculas del patógeno. Este reconocimiento conduce a la activación de un amplio rango de repuestas de defensa de la planta que detiene el crecimiento del patógeno.

En el cultivo de plantas hay una constante lucha por identificar nuevas fuentes de genes de resistencia dominantes mayoritariamente monogénicos. En las variedades cultivadas con genes de resistencia sencillos recién introducidos, con frecuencia se rompe rápidamente la protección a la enfermedad, debido a que los patógenos evolucionan y se adaptan en una alta frecuencia y recuperan la capacidad de infectar con éxito la planta hospedante. Por lo tanto, se necesita mucho la disponibilidad de nuevas fuentes de resistencia a enfermedad.

Los mecanismos de resistencia alternativos actúan por ejemplo a través de la modulación de la respuesta de defensa en plantas, tales como la resistencia mediada por el gen recesivo mlo en cebada al patógeno mildiu en polvo Blumeria graminis f. sp. hordei. Las plantas que llevan alelos mutados del gen MLO tipo natural presentan resistencia casi completa que coincide con el aborto de la penetración fúngica tratada de la pared celular de células epidérmicas atacadas sencillas. Por tanto, el gen MLO tipo natural actúa como un regulador negativo de la respuesta a patógeno. Esto está descrito en el documento WO9804586.

Otros ejemplos son los genes recesivos de resistencia a mildiu en polvo, encontrados en un cribado (“screen”) para la pérdida de susceptibilidad a Er y siphe cichoracearum. Hasta ahora se han clonado tres genes, denominados PMR6, el cual codifica una proteína similar a pectato liasa, PMR4 el cual codifica una calosa sintasa, y PMR5 el cual codifica una proteína de función desconocida. Tanto los genes mlo como pmr parecen conferir específicamente resistencia a mildiu en polvo y no a oomycetes tales como mildius vellosos.

La resistencia general a patógeno, o formas sistémicas de resistencia tales como SAR, se ha obtenido mediante dos modos principales. La primera es mediante mutación de reguladores negativos de defensa vegetal y muerte celular, tales como en los mutantes cpr, lsd y acd de Arabidopsis. La segunda es mediante sobreexpresión transgénica de inductores o reguladores de defensa vegetal, tales como en las plantas de sobreexpresión de NPR1.

La desventaja de estos mecanismos de resistencia conocidos es que, además de la resistencia a patógeno, estas plantas muestran con frecuencia fenotipos adicionales e indeseables detectables, tales como el crecimiento atrofiado o la formación espontánea de muerte celular.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar una forma de resistencia que sea general, durable y no asociada a fenotipos indeseables.

En la investigación que condujo a la presente invención, se realizó un cribado de mutante de Arabidopsis thaliana para susceptibilidad reducida al patógeno de mildiu velloso Hyaloperonospora parasitica. Se generaron mutantes EMS en la línea Ler eds1-2 de Arabidopsis muy susceptible. Se analizaron en detalle ocho mutantes resistentes a mildiu velloso (dmr, del Inglés “downy mildew resistant”) , que corresponden a 6 loci diferentes. El análisis microscópico mostró que el crecimiento de todos mutantes de H. parasitica se redujo severamente. La resistencia de dmr3, dmr4 y dmr5 estaba asociada a la activación constitutiva de la defensa vegetal. Además, los mutantes dmr3 y dmr4, pero no dmr5, eran también resistentes a Pseudomonas syringae y Golovinomyces orontii.

Por lo contrario, la activación aumentada de la defensa vegetal no se observó en los mutantes dmr1, dmr2 y dmr6. Los resultados de esta investigación se ha descrito en Van Damme et al. (2005) Molecular Plant-Microbe Interactions 18 (6) 583-592. Este artículo no describe la identificación y la caracterización de los genes DMR.

Se identificó el mutante dmr6 en un cribado de pérdida de susceptibilidad en el ambiente de Ler eds1-2 de Arabidopsis. El gen DMR6 ahora se ha clonado y caracterizado. Por tanto, se encontró que el gen DMR6 es el gen At5g24530, que codifica una oxidoreductasa (el ADN y la secuencia de aminoácidos están representados en la Figura 2) . Las oxidoreductasas son enzimas que catalizan la transferencia de electrones desde una molécula, el oxidante, a otro, el reductor. De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que la pérdida de una proteína DMR6 funcional da como resultado resistencia a mildiu velloso.

Por tanto, la presente invención proporciona una planta de lechuga, la cual es resistente a un patógeno de origen vírico, bacteriano, fúngico u oomycete, caracterizada porque la planta tiene un nivel reducido, actividad reducida o ausencia completa de la proteína DMR6 en comparación con una planta que no es resistente al dicho patógeno, de acuerdo con la reivindicación 1 adjunta.

Esta forma de resistencia es en particular eficaz frente a patógenos del filo Oomycota, tales como especies de Albugo, Aphanomyces, Basidiophora, Bremia, Hyaloperonospora, Pachymetra, Paraperonospora, Perofascia, Peronophythora, Peronospora, Peronosclerospora, Phytium, Phytophthora, Plasmopara, Protobremia, Pseudoperonospora, Sclerospora, Viennotia, así como a patógenos pertenecientes al Fungi.

La resistencia de acuerdo con la invención se basa en una actividad alterada, en particular un nivel reducido, reducida o ausencia completa de la proteína DMR6 en planta. El término “proteína DMR6” a este respecto se refiere al producto del gen DMR6, tal como la proteína codificada por el gen At5g24530 en Arabidopsis. Tales alteraciones se pueden alcanzar de diversos modos.

En una realización de la invención, el nivel reducido de la proteína DMR6 es el resultado de una expresión reducida del gen DMR6 endógeno. La reducción de la expresión del gen DMR6 se puede alcanzar, o bien directamente, tal como mediante el silenciamiento del gen, o indirectamente mediante la modificación de sus secuencias reguladoras,

o mediante la estimulación de la expresión del gen.

La modulación del gen DMR6 para rebajar su actividad o expresión se puede alcanzar en diversos niveles. Primero, el gen endógeno se puede mutar directamente. Esto se puede alcanzar por medio de un tratamiento mutagénico. Alternativamente, un gen DMR6 modificado se introduce en la planta por medio de técnicas transgénicas o por introgresión, o la expresión de DMR6 se puede reducir al nivel regulador, por ejemplo, mediante la modificación de las secuencias reguladoras o mediante el silenciamiento del gen.

De acuerdo con la invención, el nivel reducido de proteína DMR6 es el resultado de una mutación en el gen DMR6 que da como resultado una expresión reducida de DMR6 en comparación con el gen DMR6 tipo natural en el que no está presente dicha mutación, o que da como resultado un ARNm reducido o estabilidad de proteína. En una realización particular esto se alcanza mediante mutaciones en la secuencia codificadora de DMR6 que da como resultado una proteína DMR6 no funcional, es decir, sin o con actividad enzimática reducida.

En otra realización de la invención, se puede alcanzar la expresión reducida mediante la regulación a la baja de la expresión del gen DMR6 o bien al nivel transcripcional o de traducción, por ejemplo, mediante silenciamiento del gen o mediante mutaciones que afectan la expresión del gen DMR6.

Esta invención se basa en la investigación realizada sobre la resistencia a Hyaloperonospora parasitica en Arabidopsis pero es un concepto general que se puede aplicar más generalmente en plantas, en particular en plantas de cultivo que son susceptibles a infecciones con patógenos, tales como Oomycota y Fungi.

La invención es adecuada para un gran número de enfermedades de planta causadas por oomycetes tales como, pero no se limitan a, Bremia lactucae o lechuga. La descripción puede ser adecuada para Peronospora farinosa sobre... [Seguir leyendo]

1. Planta de lechuga que es resistente a Bremia lactucae, caracterizado porque la planta tiene un nivel reducido, actividad reducida o ausencia completa de proteína DMR6 en comparación con la planta que no es resistente a dicho patógeno donde dicha planta tiene una mutación en su gen DMR6 que da como resultado una proteína DMR6 con actividad enzimática reducida en comparación con la proteína DMR6 codificada por el gen DMR6 tipo natural en el que no está presente tal mutación; o dicha planta tiene una mutación en su gen DMR6 que da como resultado una expresión DMR6 reducida en comparación con el gen DMR6 tipo natural donde no está presente tal mutación.

2. Planta como la reivindicada en la reivindicación 1, en la que dicha planta tiene una mutación en su gen DMR6 que da como resultado una proteína DMR6 con actividad enzimática reducida en comparación con la proteína DMR6 codificada por el gen DMR6 tipo natural en el que tal mutación no está presente dicha mutación en el gen DMR6 conduce a una sustitución de aminoácidos en la proteína codificada.

3. Planta como la reivindicada en la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que el gen tiene la secuencia de 15 nucleótidos y la secuencia de aminoácidos como las mostradas en la Figura 3.

4. Método para obtener una planta de lechuga que es resistente a Bremia lactucae que comprende la reducción del nivel endógeno de proteína DMR6 en la planta por mutación del gen DMR6 de la planta.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la mutación se efectúa por tratamiento mutagénico de la planta, en particular con mutágenos o radiación.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la reducción del nivel endógeno en la planta se alcanza al reducir la expresión del gen DMR6 de la planta mediante silenciamiento o ARNi.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el gen DMR6 a mutar tiene la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos como las mostradas en la Figura 3.