Terpeno sintasa/ciclasa y olefina sintasa y sus utilizaciones.

Acido nucleico, o fragmento funcional del mismo, que codifica una molecula de naturaleza proteica,

en el que dicha molecula de naturaleza proteica es capaz de sintetizar, como minimo, un alcohol monoterpenico linalol cuando se pone en contacto con geranil difosfato (GPP) y, como minimo, un alcohol sesquiterpenico nerolidol cuando se pone en contacto con farnesil difosfato (FPP) en condiciones apropiadas, en el que dicho acido nucleico codifica una molecula de naturaleza proteica, que comprende una secuencia de aminoacidos o fragmento funcional de la misma que es, como minimo, el 50% identica a la secuencia H64MUT, tal como se muestra en la figura 2, o un fragmento funcional de la misma, preferentemente el 70% identica, mas preferentemente el 80% identica, mas preferentemente el 90% identica, mas preferentemente el 95% identica, y de la forma mas preferente el 99% identica.

Terpeno sintasa/ciclasa y olefina sintasa y sus utilizaciones La presente invencion se refiere al sector de la manipulacion genetica del desarrollo de un sabor, fragancia o agente de control biologico. Mas especificamente, la presente invencion se refiere a un proceso para la produccion de compuestos isoprenoides bioactivos mediante el control o la modulacion de uno o mas genes implicados en ese proceso. Los isoprenoides son el grupo mas grande y mas diverso de compuestos secundarios vegetales. Como minimo, se han descrito 20.000 isoprenoides y, sin duda, much os mas se descubriran en el futuro. Por definicion, los isoprenoides estan compuestos por las llamadas unidades de isopreno (C5) . Esto se puede reconocer en el numero de atomos de C presente en los isoprenoides, que habitualmente pueden dividirse entre cinco (C5, C10, C15, C20, C25, C30 y C40) , aunque tambien se han descrito isoprenoides y politerpenos irregulares. Son miembros importantes de los isoprenoides, entre otros, los carotenoides, giberelinas, acido abscisico, algunas citoquinas, esteroles y los terpenoides, que comprenden, entre otros, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, tetraterpenos y politerpenos (gomas) , etc. La mayoria de estos compuestos se producen en forma libre, pero tambien pueden estar modificados, o derivatizados como esteres y glucosidos, o unidos a proteinas. Entre los isoprenoides hay muchos compuestos con actividad biologica, por ejemplo, como r eguladores del crecimiento vegetal (giberelinas, acido abscisico, citoquinas) , y en la interaccion entre plantas y otros organismos (por ejemplo como anti-microbianos, infoquimicos y los isoprenoides estimuladores de la germinacion que son exudados por las raices de algunas especies vegetales e inducen la germinacion de semillas de malas hierbas parasitas) . Los monoterpenos y sesquiterpenos, la rama de C10 y C15 de la familia de los isoprenoides, fueron investigados por su valor economicamente interesante como compuestos generadores de sabor y fragancia en alimentos y cosmeticos y sus propiedades anti-carcinogenas y antimicrobianas. Los monoterpenos y sesquiterpenos tambien han mostrado tener importancia ecologica, por ejemplo, en la interaccion entre plantas, plantas e insectos/aranuelas (acaros d e la familia Tetranychidae) y p lantas y microorganismos. Por lo tanto, las pl antas que producen monoterpenos y sesquiterpenos han sido investigadas por muchos autores y esto ha dado como resultado una mejor comprension de las rutas bioquimicas que conducen a la formacion de estos compuestos y sus derivados. El linalol es un alcohol monoterpenico aciclico que tiene un peculiar sabor dulce floral y cremoso. En Clarkia breweri (Onagraceae) el linalol, entre otros compuestos, es responsable de la atraccion de polillas polinizadoras. El linalol es uno de los compuestos volatiles liberados como semioquimicos despues del ataque de un herbivoro en algunas plantas y, como tal, puede atraer a depredadores de los herbivoros. El sabor dulce del linalol le hace adecuado para mejorar el sabor a arandanos de productos alimentarios, especialmente de bebidas (patente de Estados Unidos Nº 4041185) . Ademas, se sabe que el linalol tiene una actividad antimicrobiana de amplio espectro. Se ha descrito por Pattnaik y otros (Microbios 89: 39-46, 1997) , que muestra actividad antibacteriana contra bacterias Gram positivas y Gram negativas, asi como actividad antifungica contra hongos similares a levadura y filamentosos. El nerolidol, el analogo sesquiterpenico del monoterpenoide linalol, es un componente de muchos aceites esenciales y camaras volatiles florales (Bauer y otros, Common Fragrance and Flavor Materials. Preparations, Properties and Uses [Materi ales ha bituales de fraga ncia y s abor. Preparacio nes, propie dades y util izaciones], VCH Verlaggesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990; Knudsen y otros, Phytochemistr y [Fitoquimica] 33: 253-280, 1993) . Se ha descrito que el nerolidol tiene actividad antimicrobiana. El documento EP 0420630A2 describe la utilizacion de nerolidol en una composicion oral antiplaca. Bouwmeester y otros (Plant Physiol. 121: 173-180, 1999) para pepino y judia de Lima y Degenhardt y Gershenzon (Planta 210: 815-822, 2000) para maiz, demostraron que la biosintesis de nerolidol es inducida, respectivamente, despues de la alimentacion por parte d e aranuelas o Spodoptera. La enzima resp onsable de l a formacion de nerolidol cataliza la etapa reguladora en la formacion de la importante molecula de senalizacion 4, 8-dimetil-1, 3 (E) , 7nonatrieno. Tanto el n erolidol como el 4, 8-dimetil-1, 3 (E) , 7-nonatrieno son importantes constituyentes de la mezcla volatil producida en el maiz, despues de la alimentacion de larvas de gardama (Turlings y otros, Science 250: 1251-1253, 1990; Degenhardt y Gershenzon, 2000) y en gerbera en respuesta a la alimentacion por parte de aranuelas (Krips y otros, J. Chem Ecol 1999) . Tambien en la camara volatil de varias flores, el nerolidol es un importante constituyente a menudo junto con 4, 8-dimetil-1, 3 (E) , 7-nonatrieno (Kaiser, en: Perfumes: Art, Science and Technology [Perfumes: arte, ciencia y tecnologia], Elsevier Science Publishers, Essex, Reino Unido, pags. 213-250, 1991; Knudsen y otros, 1993) . Tambien se ha descrito el nerolidol como constituyente de mezclas de feromonas en una serie de insectos y aranuelas (Aldrich-JR; Lusby-WR; Kochansky-JP, Experientia. 1986, 42: 5, 58 3-585; Regev-S; Cone-WW. Environmental-Entomology [Entomologia medioambiental] 1976, 5: 1, 133-138) y se ha descrito como acaricida si se formula en un sustrato de liberacion controlada (patente de Estados Unidos Nº 4775534) . Ademas, se ha descrito que el nerolidol es un repelente de mosquitos extremadamente eficaz.

A partir de una serie de plantas, se han aislado varios ADNc que codifican enzimas implicadas en la biosintesis de monoterpenoides, tales como S-linalol y R-linalol sintasas (Cseke y otros, Mol. Biol. Evol. 15: 1491-1498, 1998; Jia y otros, Arch Biochem Biophys 372: 143-149, 1999) , (-) -4S limoneno sintasa (Colby y otros, J Biol Chem 268: 2301623024, 1993; Bohlmann y otros, J Biol Chem 272: 21784-21792, 1997) .

El documento WO 9715584 describe la utilizacion de S-linalol sintasa, una monoterpeno aciclico sintasa, en la manipulacion genetica de la produccion de aroma. La utilizacion de la limoneno (monoterpeno) ciclasa en el control del gusano de la raiz del maiz, insertand o una secuencia de nucleotidos que codifica limoneno ciclasa en las plantas, se describe en el documento WO 9637102. En el documento WO 0022150, se describe la utilizacion de una limoneno sintasa, linalol sintasa y combinacion de limoneno y carveol sintasa (denominada en realidad limoneno hidroxilasa) p ara el c ontrol de ins ectos. Sin emb argo, los prod uctos terpen oides se formaron solame nte e n combinacion con una GPP sintasa.

Las enzimas implicadas en la produccion de precursores para la sintesis de los esqueletos de monoterpeno primario estan todas activas en los plastos, dado que todos los genes clonados de esta ruta hasta ahora tienen senales de direccion a los plastos. Recientemente, para una enzima, (4S) -limoneno sintasa, la localizacion en los leucoplastos de l as ce lulas secretoras e n Mentha spicata se ha demostrado c on inmu nomarcado co n or o. L as sen ales de direccion a los plastos indican que los precursores de isoprenoide para el metabolismo del monoterpeno se forman en los plastos, aunque se ha demostrado que se produce cierta division de estos precursores entre los diferentes compartimentos celulares de las plantas. A diferencia de otras monoterpeno (yditerpeno) ciclasas, que portan peptidos trans itorios esci ndibles de 50-70 aminoacidos, el ADNc de S-linalol s intasa aisl ado por Pichersk y y colaboradores, codific a una protein a co n un peptido escindible evi dente de, com o ma ximo, so lamente oc ho aminoacidos de largo. Sin embargo, se descubrieron caracteristicas de senal de direccion al plasto tipicas en los primeros 60 a minoacidos de l ADNc, lo que ap oya q ue l a enzim a li nalol sintas a, co mo se esp eraba p ara u na monoterpeno sintasa, es dirigida, de hecho, a los plastos.

Dos clones de ADNc independientes que codifican 5-epi-aristoloqueno sintasa (EAS) de tabaco han sido aislados y caracterizados por Facchini yChappell (Proc Natl Acad. Sci. Estados Unidos, 89: 11088-11092, 1992) . Back y Chappell describieron la clonacion y la expresion bacteriana de vetispiradieno sintasa descubierta en Hyoscyamus muticus (J. Biol. Chem., 270 (13) : 7375-7381, 1995) . El ADNc que codifica amoría-4, 11-dieno sintasa, un intermedio en la biosintesis del antimalarico artemisinina, fue aislado y caracterizado por Mercke y otros (Arch. Biochem. Biophys., 381 (1) : 173-180, 2000) . La biosintesis de sesquiterpeno esta compartimentalizada en el citosol,... [Seguir leyendo]

1. ºcido nucleico, o fragmento funcional del mismo, que codifica una molecula de naturaleza proteica, en el que dicha molecula de naturaleza proteica es capaz de sintetizar, como minimo, un alcohol monoterpenico linalol cuando se pone en contacto con geranil difosfato (GPP) y, como minimo, un alcohol sesquiterpenico nerolidol cuando se pone en contacto con farnesil difosfato (FPP) en condiciones apropiadas, en el que dicho acido nucleico codifica una molecula de naturaleza proteica, que comprende una secuencia de aminoacidos o fragmento funcional de la misma que es, como minimo, el 50% identica a la secuencia H64MUT, tal como se muestra en la figura 2, o un fragmento funcional de la misma, preferentemente el 70% identica, mas preferentemente el 80% identica, mas preferentemente el 90% identica, mas preferentemente el 95% identica, y de la forma mas preferente el 99% identica.

2. ºcido nucleico, segun la reivindicacion 1, en el que dicho acido nucleico codifica una molecula de naturaleza proteica que comprende una secuencia de aminoacidos o fragmento funcional de la misma que es identica a la secuencia H64MUT, tal como se muestra en la figura 2, o la secuencia H64NORS, tal como se muestra en la figura 2, o la secuencia H64VES, tal como se muestra en la figura 2, o un fragmento funcional de la secuencia H64MUT, H64NORS o H64VES.

3. Secuencia de acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que puede obtenerse de un eucariota, preferentemente una planta, mas preferentemente fresa.

4. Secuencia de acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, provista de un aci do nucleico que codifica una senal de direccion a plastos o un acido nucleico que codifica una senal de direccion a mitocondrias.

5. ºcido nucleico, segun cualquiera de las r eivindicaciones 1-4, que codif ica una molecula de naturaleza proteica capaz de la sintesis de un compuesto bioactivo isoprenoide en el citosol, plasto o mitocondria en una celula, cuando se le suministra un sustrato adecuado en condiciones de reaccion apropiadas.

6. Vector que comprende un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Huesped transgenico que comprende un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o un vector, segun la reivindicacion 6.

8. Huesped transgenico, segun la reivindicacion 7, en el que dicho huesped expresa una nerolidol sintasa/ciclasa o una monoterpeno sintasa/ciclasa.

9. Huesped transgenico, segun la reivindicacion 7 u 8, en el que dicho huesped es una planta o material de propagacion obtenido de la misma.

10. Metodo para producir un sabor, fragancia y/o agente de control biologico que comprende, a) transformar o transfectar un huesped adecuado con, como minimo, un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 15, o un vector, segun la reivindicacion 6; b) expresar dicho acido nucleico en presencia de un sustrato adecuado.

11. Metodo, segun la reivindicacion 10, que comprende, ademas, la etapa c) de aislar el producto formado.

12. Metodo para proporcionar resistencia a patogenos en una planta, transformando o transfectando una planta con, como minimo, un acido nucleico, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o un vector, segun la reivindicacion 6, y expresar dicho acido nucleico en presencia de un sustrato adecuado.

13. Metodo, segun la reivindicacion 12, en el que se proporciona resistencia contra hongos y/o insectos.